西咪替丁對低劑量60Coγ射線照射小鼠腸道免疫組織的保護作用

何穎，張俊玲，沈先榮，趙憶寧，劉玉明，劉瓊，李珂嫻，陳偉，羅群，原維鴻

腸道是電離輻射最敏感的靶器官之一，腸黏膜屏障則是腸道放射損傷的首要靶點。全身或腹部局部照射后會出現(xiàn)小腸損傷，嚴重時可導致急性放射性腸炎，甚至腸型放射病而死亡[1-3]。隨著我國核能和平利用的增多及放射治療的普及，腸道輻射損傷患者也越來越多，但迄今有關腸道輻射損傷的治療尚無理想的方法。一直以來對急性放射損傷研究較多，對平戰(zhàn)時低劑量和低劑量率電離輻射導致的環(huán)境和健康危害[4-6]認識不夠，相關研究進展緩慢。

西咪替丁(cimetidine，CMD)臨床上主要用于治療十二指腸潰瘍、上消化道出血等。隨著藥理學研究的不斷深入，西咪替丁作為免疫調節(jié)藥物已成功用于修復惡性腫瘤、低丙種球蛋白血癥、多形紅斑、銀屑病以及艾滋病相關綜合征等的免疫功能[7-10]。研究還發(fā)現(xiàn)，西咪替丁具有許多不同于其他H2受體拮抗劑的新用途，尤其是其輻射防護作用[11-14]，該作用的發(fā)揮與受照動物免疫功能調節(jié)有關。相關證據(jù)包括，照射前給予西咪替丁可抑制T抑制性細胞及促進CD4+淋巴細胞增殖[15-16]。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，西咪替丁能促使低劑量率中子和γ射線混合照射大鼠的淋巴細胞增殖，且其胸腺指數(shù)和脾指數(shù)明顯升高[17]。

作為機體接觸外來抗原最多的器官，腸道含有豐富的對射線高度敏感的淋巴細胞。本研究著眼于腸道免疫系統(tǒng)，采用1.0Gy60Co γ射線照射小鼠，探討西咪替丁對較低劑量照射小鼠腸道免疫功能的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 流式細胞儀(BD Accuri C6，BD公司，美國)。西咪替丁(山西同達藥業(yè)有限公司，批號：140401)；陽性藥物523(軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，批號：20080801)；細胞凋亡原位末端轉移酶標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測試劑盒(Roche公司，瑞士)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素+碘化丙啶(annexin-V-fluorescein isothiocyanate+propidium iodide，Annexin-V-FITC+PI)凋亡檢測試劑盒(BD公司，美國)；FITC標記抗小鼠分化抗原(cluster of differentiation，CD)3抗體(BioLegend公司，美國)；藻紅蛋白-菁色素(phycoerythrin-cyanine5，PE-Cy5)標記抗小鼠 CD19抗體(eBioscience公司，美國)。

1.2 實驗動物與分組 雄性C57小鼠，6～8周齡，體重(20±2)g，動物合格證號：SCXK(滬)2013-0016。60只小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照(NC)組，照射模型(RM)組，陽性對照(PC)組，西咪替丁低劑量(CMDL)組(33.3mg/kg)，西咪替丁中劑量(CMDM)組(100mg/kg)，西咪替丁高劑量(CMDH)組(300mg/kg)。實驗方案通過第二軍醫(yī)大學海軍醫(yī)學研究所動物倫理委員會批準，動物處置過程中所有操作均符合動物倫理學標準。

1.3 照射及給藥方案 照射地點為海軍醫(yī)學研究所輻照中心，除正常對照組外，其他各組以60Co γ射線全身照射，照射劑量為1.0Gy，劑量率為8.33mGy/min。西咪替丁各劑量組照射前經(jīng)口連續(xù)給藥6d，每天1次，照射后5h再給藥1次；陽性藥物523于照射前1d經(jīng)口給藥1次，20mg/kg，照射后5h給藥1次，10mg/kg。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠腸免疫組織病理形態(tài)學觀察 照射后24h取小鼠小腸，10%甲醛溶液固定2～3d后，石蠟包埋制片，行蘇木素-伊紅(HE)染色和過碘酸-雪夫(periodic acid- Schiff，PAS)染色，光鏡下觀察腸免疫組織損傷、修復情況及杯狀細胞數(shù)量變化并采集圖像。

1.4.2 TUNEL法檢測小腸黏膜免疫細胞凋亡 采用細胞凋亡檢測試劑盒，參照試劑盒說明書進行檢測。石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復、封閉、標記、顯色、復染等處理，光鏡下觀察小腸組織TUNEL染色情況。

1.4.3 全腸派伊爾結(Peyer's patch，PP)淋巴細胞懸液制備 照射后24h活殺小鼠，沿腸壁剪下PP，于0.01mmol/L PBS(含1%胎牛血清)體系中100目網(wǎng)篩研磨、過濾；濾液3000r/min離心5～10s，并重懸于NH4Cl溶液，待用。

1.4.4 流式細胞術檢測腸PP淋巴細胞凋亡率 用0.01mmol/L PBS調整細胞密度為1×106個/ml，取lml細胞重懸于200μl結合緩沖液，加入10μl Annexin-V及5μl PI，室溫避光反應15min，加入300μl結合緩沖液。流式細胞儀檢測淋巴細胞凋亡率。

1.4.5 流式細胞術檢測T、B細胞數(shù)的變化 調整細胞密度至1×107個/ml。加入2μl FITC標記抗CD3抗體及4μl PE-Cy5標記抗CD19抗體，混勻；室溫避光反應30min，0.01mmol/L PBS洗滌并重懸細胞于500μl體系；流式細胞儀檢測T、B淋巴細胞群數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 對小鼠腸免疫組織病理損傷的影響 正常對照組小鼠小腸各部分結構染色清晰，絨毛完整，柱狀上皮細胞排列整齊，黏膜內固有層及淋巴管中淋巴免疫細胞形態(tài)結構正常，未見水腫現(xiàn)象(圖1A)。1.0Gy照射后24h，小腸絨毛整體胞質著色變淡，有輕微損傷(圖1B)。陽性藥對照組腸絨毛上皮細胞排列相對整齊(圖1C)；西咪替丁各劑量組腸腺結構完整，絨毛上皮細胞排列致密，上皮細胞之間緊密連接，腸組織總體結構接近正常(圖1D－F)。

圖1 小鼠腸免疫組織病理學變化(HE ×200)Fig.1 Pathological changes of intestinal immune tissues in mice (HE staining ×200)

2.2 對小鼠小腸杯狀細胞的影響 杯狀細胞呈高腳酒杯狀，細胞上端膨大，下端細小，杯內積有大量的黏液顆粒。HE染色由于標本處理的原因鏡下黏液顆粒丟失而呈空泡狀。PAS染色即糖原染色后紅染部分為杯狀細胞。如圖2A所示，正常對照組杯狀細胞分布廣泛。1.0Gy60Co γ射線照射后24h，腸腺(隱窩)處杯狀細胞染色較淡(圖2B)，表明杯狀細胞有輕微損傷。陽性藥對照組除了腸腺處染色較淡，其他各處均接近正常對照組(圖2C)。西咪替丁各劑量組與正常對照組比較未見明顯變化，提示杯狀細胞較為正常(圖2D－F)。

圖2 小鼠小腸杯狀細胞的變化(PAS ×200)Fig.2 Changes of goblet cells in small intestine of mice (PAS staining ×200)

2.3 對小鼠腸道淋巴細胞凋亡的影響 TUNEL檢測結果顯示，正常對照組小鼠腸免疫組織中偶見凋亡細胞，核呈棕黃色改變(圖3A)。照射后24h，腸黏膜免疫組織中凋亡的淋巴細胞明顯增加(圖3B)，尤其在固有層隱窩處更為明顯。陽性藥對照組黏膜固有層及黏膜絨毛內可見凋亡的淋巴細胞(圖3C)。西咪替丁各劑量組僅在隱窩處見少量凋亡的淋巴細胞，與照射模型組比較，凋亡的細胞明顯減少，接近正常對照組(圖3D－F)。

流式細胞術檢測結果進一步顯示，1.0Gy60Co γ射線照射后24h，模型對照組小鼠腸道PP淋巴細胞凋亡率較正常對照組明顯增加(P＜0.01)，約是后者的2倍(表1)。與模型對照組比較，各給藥組PP淋巴細胞凋亡率均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義；其中西咪替丁中劑量組抑制輻射所致PP淋巴細胞凋亡的作用最強，優(yōu)于陽性藥對照組(P＜0.01)。

表1 西咪替丁對低劑量照射小鼠腸道PP淋巴細胞凋亡的影響(±s，n=10)Tab.1 Effect of CMD on intestinal Peyer's patch lymphocytes apoptosis in low dose-irradiated mice (±s,n=10)

表1 西咪替丁對低劑量照射小鼠腸道PP淋巴細胞凋亡的影響(±s，n=10)Tab.1 Effect of CMD on intestinal Peyer's patch lymphocytes apoptosis in low dose-irradiated mice (±s,n=10)

NC.Normal control group; RM.Radiation model group; PC.Positive control group; CMDL.Low dose of CMD group; CMDM.Middle dose of CMD group; CMDH.High dose of CMD group.(1)P＜0.05,(2)P＜0.01 compared with NC; (3)P＜0.05,(4)P＜0.01 compared with RM group

Group Apoptosis rate (%)NC 0.73±0.06 RM 1.48±0.22(2)PC 0.98±0.22(3)CMDL 1.08±0.01(1)(3)CMDM 0.85±0.17(4)CMDH 1.00±0.20(3)

2.4 對小鼠腸道PP中T、B淋巴細胞數(shù)的影響 流式細胞術檢測結果顯示，1.0Gy60Co γ射線照射后24h，小鼠腸道PP內T、B淋巴細胞數(shù)量均較正常對照組明顯下降(P＜0.01，P＜0.05，表2)。與模型對照組比較，照射后24h，各給藥組T淋巴細胞數(shù)量均明顯上升，差異均有統(tǒng)計學意義，除了西咪替丁中劑量組以外，各給藥組B淋巴數(shù)量也明顯上升(P＜0.01)。

表2 西咪替丁對低劑量照射小鼠腸道PP中T、B淋巴細胞數(shù)的影響(±s，n=10)Tab.2 Effect of CMD on the T and B lymphocytes in intestinal Peyer's patch of low dose-irradiated mice (±s,n=10)

表2 西咪替丁對低劑量照射小鼠腸道PP中T、B淋巴細胞數(shù)的影響(±s，n=10)Tab.2 Effect of CMD on the T and B lymphocytes in intestinal Peyer's patch of low dose-irradiated mice (±s,n=10)

NC.Normal control group; RM.Radiation model group; PC.Positive control group; CMDL.Low dose of CMD group; CMDM.Middle dose of CMD group; CMDH.High dose of CMD group.(1)P＜0.05,(2)P＜0.01 compared with NC; (3)P＜0.05,(4)P＜0.01 compared with RM group

Group CD3+ T cells (%) CD19+ B cells (%)NC 57.66±7.16 79.96±8.93 RM 35.64±10.09(2) 67.78±6.44(1)PC 61.35±9.34(4) 82.83±3.55(4)CMDL 64.80±6.20(4) 83.80±2.39(4)CMDM 56.02±9.16(3) 75.48±8.08 CMDH 60.40±4.70(4) 82.50±4.71(4)

圖3 小鼠腸免疫組織淋巴細胞凋亡情況(TUNEL ×200)Fig.3 Lymphocyte apoptosis in intestinal immune tissue of mice (TUNEL staining ×200)

3 討 論

小腸組織對射線高度敏感，而腸黏膜屏障是腸道放射損傷的關鍵部位[18]。腸黏膜除了具有消化、吸收、分泌和屏障等重要功能以外，還含有豐富的免疫細胞和分子，是機體最大的免疫組織。腸黏膜免疫組織包括PP、固有層淋巴細胞(lamina propria lymphocytes，LPL)和上皮內淋巴細胞(intraepithelial lymphocytes，IEL)。PP為腸黏膜免疫的傳入誘導部分，LPL和IEL為效應部分，三者共同構成腸黏膜免疫屏障。研究表明，輻射損傷后腸黏膜免疫組織主要表現(xiàn)為淋巴細胞損失及隨后的增殖反應[18]。3.0Gy γ射線照射后8h，IEL數(shù)量即減少[19]。較低劑量照射時，雖不至于發(fā)生腸型放射病，但對腸道免疫組織也會造成一定程度的損傷，繼而影響腸道正常功能。

本實驗觀察了1.0Gy60Co γ射線照射后小鼠腸道免疫組織的病理學變化，發(fā)現(xiàn)僅照射模型組絨毛整體胞質著色變淡，有輕微損傷，各組PAS染色未見明顯差異；TUNEL檢測結果顯示，照射模型組小鼠小腸組織內可見上皮細胞和淋巴細胞凋亡，以淋巴細胞為主，在固有層腸腺(隱窩)處更為明顯；說明較低劑量照射對小腸組織形態(tài)結構及杯狀細胞影響不大，損傷較輕，主要導致隱窩處淋巴細胞凋亡。與照射模型組比較，西咪替丁各劑量組絨毛上皮細胞排列整齊，腸形態(tài)結構整體更接近正常，僅在隱窩處見少量淋巴細胞的凋亡，表明西咪替丁能明顯減少小腸免疫組織內淋巴細胞凋亡，有效改善1.0Gy60Co γ射線照射導致的輕微損傷。

腸黏膜的免疫功能包括免疫誘導和免疫應答，免疫應答的性質和程度主要取決于誘導部位的狀態(tài)和功能。腸PP作為腸黏膜免疫的誘導部位，主要包括T細胞和B細胞兩個功能性淋巴細胞群，對維持腸上皮屏障的完整性、調節(jié)其屏障功能具有重要意義，在腸黏膜免疫中發(fā)揮著關鍵作用[20-26]。因此，保護PP淋巴細胞，維護腸黏膜免疫功能，是防治較低劑量輻射導致的腸道損傷的有效手段。本實驗通過流式細胞術檢測1.0Gy60Co γ射線照射后小鼠腸道PP內T、B淋巴細胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)照射后24h，T、B淋巴細胞數(shù)量均明顯下降，西咪替丁則能使T、B淋巴細胞數(shù)量保持穩(wěn)定，說明較低劑量的γ射線即可導致腸黏膜免疫組織淋巴細胞數(shù)量減少，而西咪替丁可有效防止電離輻射誘導的T、B淋巴細胞數(shù)量下降。

已有研究發(fā)現(xiàn)，低或中等劑量的γ射線所致外周血淋巴細胞死亡方式主要是凋亡，電離輻射(主要是γ射線)可誘發(fā)腸免疫細胞凋亡。腸PP淋巴細胞受亞致死劑量γ射線照射后數(shù)量明顯減少[27]。5.5～12.0Gy γ射線照射后，腸道PP淋巴細胞以凋亡為顯著表現(xiàn)[28]。2002年，Kojima等[29]通過離體人外周血淋巴細胞實驗，證實了西咪替丁對大劑量X射線誘導的淋巴細胞微核發(fā)生和細胞凋亡有保護作用，可以抑制輻射誘導的caspase-3凋亡途徑。本次實驗中，TUNEL和流式細胞術檢測結果均表明1.0Gy60Co γ射線照射后24h，腸黏膜免疫組織中發(fā)生凋亡的淋巴細胞明顯增加，而西咪替丁能有效抑制輻射誘導的淋巴細胞凋亡。

綜上所述，西咪替丁于照射前6d連續(xù)口服給藥和照射后5h內給藥，可防止1.0Gy60Co γ射線導致的小鼠腸PP內T、B淋巴細胞數(shù)量減少，抑制輻射誘導的腸黏膜免疫組織中淋巴細胞凋亡，有效改善較低劑量照射小鼠引起的腸免疫組織損傷。