復(fù)方地黃顆粒對(duì)陰虛動(dòng)風(fēng)證帕金森病模型大鼠神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體的影響

梁建慶，何建成

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，目前尚無理想的防治措施，傳統(tǒng)治療以左旋多巴(3,4-dihydroxyphenyl-lalanine，L-DOPA)為主，但常出現(xiàn)諸多不良反應(yīng)如“開關(guān)”現(xiàn)象、異動(dòng)癥等，且隨著服用藥物時(shí)間的延長(zhǎng)，不良反應(yīng)明顯加重。本課題組前期研究表明，無論是在PD治療，還是降低L-DOPA的不良反應(yīng)方面，復(fù)方地黃顆粒均有較好療效[1]。基于此，本研究制備陰虛動(dòng)風(fēng)證PD大鼠模型，采用復(fù)方地黃顆粒進(jìn)行干預(yù)治療，檢測(cè)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTFs)及其受體表達(dá)，以探索復(fù)方地黃顆粒治療PD的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件 雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重180～200g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SYXK(滬)2008-0016)。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫(23±2)℃，相對(duì)濕度60%～65%，自動(dòng)光-暗控制(7:00～19:00光照，19:00～7:00暗置)，動(dòng)物攝食、飲水及活動(dòng)自由。

1.2 主要試劑和儀器 6-羥基多巴胺(6-OHDA，批號(hào)：MKBP0832V)、阿撲嗎啡(apomorphine，APO，批號(hào)：SLBF6369V)、抗壞血酸(批號(hào)063K1082)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；美多芭(Madopar，0.25g/片，批號(hào)：SH1737)購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司；慶大霉素(0.3g/支)購(gòu)自上海第一制藥廠?？股窠?jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)抗體、抗腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)抗體、抗膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)抗體、抗原肌球蛋白受體激酶A(tropomyosin receptor kinase A，TrkA)抗體、抗TrkB抗體、抗Ret抗體、抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體、抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；抗GDNF家族受體α1(GDNF family receptor α1，GFRα1)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。大鼠腦立體定位儀(RWD-68003型)購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(FC-M型)購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple公司。

1.3 藥物制備 復(fù)方地黃顆粒委托國(guó)家中藥制藥工程技術(shù)研究中心制備。處方：熟地黃、白芍、鉤藤、珍珠母、丹參、石菖蒲、全蝎，上海中醫(yī)藥大學(xué)提供。制法：以上七味，加水浸泡、煎煮、濾過，濾液減壓濃縮成相對(duì)密度1.30(60℃)的清膏，減壓干燥，粉碎。輔料采用淀粉與糊精的等比混合物，浸膏粉與輔料比為2:1。大鼠的每日用藥量按孫瑞元教授[2]創(chuàng)制的標(biāo)準(zhǔn)體重大鼠每日用量方法計(jì)算。

1.4 模型制備、分組及給藥 陰虛動(dòng)風(fēng)證PD大鼠模型采用Ungerstedt等[3]建立并經(jīng)過本課題組驗(yàn)證的二點(diǎn)法進(jìn)行構(gòu)建[4-6]。采用分層隨機(jī)法將50只陰虛動(dòng)風(fēng)證PD模型大鼠隨機(jī)分為5組：模型組(Model組)，美多芭組(Madopar組，150mg/kg)，復(fù)方地黃顆粒低劑量組(CLD組，3.5g/kg)、復(fù)方地黃顆粒中劑量組(CMD組，7g/kg)、復(fù)方地黃顆粒高劑量組(CHD組，14g/kg)，每組10只；另取大鼠10只不作造模處理設(shè)為正常對(duì)照組(NC組)，10只只注射0.2%抗壞血酸設(shè)為假手術(shù)組(SO組)。復(fù)方地黃顆粒和美多芭分別用蒸餾水溶解，每天灌胃1次；正常對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組以等體積蒸餾水(2ml/只)灌胃，連續(xù)用藥6周。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 RT-qPCR檢測(cè)大鼠損毀側(cè)紋狀體神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體mRNA以及黑質(zhì)及紋狀體TH mRNA水平

每組各取6只大鼠，采用3%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，迅速開顱取出腦組織，在冰上小心分離損毀側(cè)黑質(zhì)和紋狀體，稱重后凍存?zhèn)溆?。提取總RNA，合成cDNA模板，引物序列見表1。擴(kuò)增條件：95℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸1min，共循環(huán)40次。采用2–ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)水平[7]。

1.5.2 Western blotting法檢測(cè)大鼠損毀側(cè)紋狀體NGF、BDNF、GDNF蛋白以及黑質(zhì)及紋狀體TH蛋白表達(dá) 常規(guī)蛋白質(zhì)抽提，行Western blotting分析。采用AlphaView圖像分析軟件對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin為參照計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示。在滿足方差齊性條件下，多組間比較采用單因素方差分析進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 RT-qPCR測(cè)定用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體引物序列Tab.1 Primer sequences of neurotrophic factors and their receptors for RT-qPCR

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方地黃顆粒對(duì)大鼠損毀側(cè)紋狀體相關(guān)因子mRNA以及黑質(zhì)及紋狀體TH mRNA水平的影響與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret、TH的mRNA水平明顯降低(P＜0.01)；與模型組比較，美多芭組及復(fù)方地黃顆粒各劑量組大鼠NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret、TH mRNA水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；美多芭組及復(fù)方地黃顆粒中劑量組上述因子mRNA水平明顯高于復(fù)方地黃顆粒低劑量及高劑量組(P＜0.01)；復(fù)方地黃顆粒中劑量組mRNA水平與美多芭組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

表2 復(fù)方地黃顆粒對(duì)PD模型大鼠損毀側(cè)紋狀體相關(guān)因子及黑質(zhì)、紋狀體TH的mRNA水平的影響(±s，n=6)Tab.2 Effect of compound Rehmannia granule on the mRNA levels of related factors of lesioned striatum and TH of substantia nigra in PD model rats (±s,n=6)

表2 復(fù)方地黃顆粒對(duì)PD模型大鼠損毀側(cè)紋狀體相關(guān)因子及黑質(zhì)、紋狀體TH的mRNA水平的影響(±s，n=6)Tab.2 Effect of compound Rehmannia granule on the mRNA levels of related factors of lesioned striatum and TH of substantia nigra in PD model rats (±s,n=6)

NC.Normal control; SO.Sham operation; CLD.Compound low dose; CMD.Compound medium dose; CHD.Compound high dose; NGF.Nerve growth factor; BDNF.Brain derived neurotrophic factor; GDNF.Glial cell line-derived neurotrophic factor.(1)P＜0.01 compared with NC group; (2)P＜0.01 compared with model group; (3)P＜0.01 compared with CLD and CHD group; (4)P＜0.01 compared with Madopar group

Group NC SO Model Madopar CLD CMD CHD NGF 0.9902±0.01910.9926±0.02000.1548±0.0123(1)0.8018±0.0131(2)(3)0.5293±0.0191(2)0.7965±0.0153(2)(3)(4)0.3267±0.0147(2)BDNF 0.9940±0.02500.9917±0.02440.2570±0.0161(1)0.7537±0.0271(2)(3)0.5551±0.0196(2)0.7536±0.0293(2)(3)(4)0.4452±0.0195(2)GDNF 0.9995±0.02400.9917±0.02450.2013±0.0295(1)0.7047±0.0306(2)(3)0.4583±0.0202(2)0.7032±0.0302(2)(3)(4)0.3544±0.0203(2)TrkA 1.0000±0.02551.0004±0.02500.2251±0.0159(1)0.7813±0.0189(2)(3)0.4807±0.0191(2)0.7812±0.0217(2)(3)(4)0.3135±0.0145(2)TrkB 0.9924±0.01370.9834±0.03350.1839±0.0277(1)0.7740±0.0423(2)(3)0.5844±0.0286(2)0.7766±0.0416(2)(3)(4)0.3953±0.0177(2)GFR-α10.9825±0.0276 0.9942±0.02690.1658±0.0168(1)0.8256±0.0301(2)(3)0.4837±0.0211(2)0.8040±0.0153(2)(3)(4)0.2950±0.0287(2)Ret 0.9827±0.0256 0.9957±0.02830.2451±0.0291(1)0.7529±0.0204(2)(3)0.6026±0.0282(2)0.7740±0.0265(2)(3)(4)0.3785±0.0346(2)TH 0.9985±0.02640.9988±0.01450.1753±0.0135(1)0.7942±0.0291(2)(3)0.5040±0.0273(2)0.8035±0.0284(2)(3)(4)0.3145±0.0144(2)

2.2 復(fù)方地黃顆粒對(duì)大鼠損毀側(cè)紋狀體NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret蛋白，以及黑質(zhì)及紋狀體TH蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret、TH的蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01)；與模型組比較，美多芭組及復(fù)方地黃顆粒各劑量組大鼠NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret、TH 蛋白的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；美多芭組及復(fù)方地黃顆粒中劑量組蛋白表達(dá)水平明顯高于復(fù)方地黃顆粒低劑量及高劑量組(P＜0.01)；復(fù)方地黃顆粒中劑量組的蛋白表達(dá)水平與美多芭組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表3，圖1)。

表3 復(fù)方地黃顆粒對(duì)PD模型大鼠損毀側(cè)紋狀體相關(guān)因子及黑質(zhì)、紋狀體TH的蛋白表達(dá)的影響(/β-actin，±s，n=6)Tab.3 Effect of compound Rehmannia granule on expression levels of related factors of lesioned striatum and TH of substantia nigra in PD model rats (/β-actin,±s,n=6)

表3 復(fù)方地黃顆粒對(duì)PD模型大鼠損毀側(cè)紋狀體相關(guān)因子及黑質(zhì)、紋狀體TH的蛋白表達(dá)的影響(/β-actin，±s，n=6)Tab.3 Effect of compound Rehmannia granule on expression levels of related factors of lesioned striatum and TH of substantia nigra in PD model rats (/β-actin,±s,n=6)

NC.Normal control; SO.Sham operation; CLD.Compound low dose; CMD.Compound medium dose; CHD.Compound high dose; NGF.Nerve growth factor; BDNF.Brain derived neurotrophic factor; GDNF.Glial cell line-derived neurotrophic factor.(1)P＜0.01 compared with NC group; (2)P＜0.01 compared with model group; (3)P＜0.01 compared with CLD and CHD group; (4)P＜0.01 compared with Madopar group

Group NC SO Model Madopar CLD CMD CHD NGF 1.364±0.008 1.366±0.012 0.327±0.016(1) 0.887±0.022(2)(3) 0.634±0.020(2) 0.882±0.017(2)(3)(4) 0.521±0.011(2)BDNF 1.889±0.011 1.896±0.008 0.264±0.014(1) 0.988±0.012(2)(3) 0.820±0.016(2) 1.002±0.019(2)(3)(4) 0.526±0.012(2)GDNF 0.912±0.028 0.902±0.029 0.077±0.010(1) 0.710±0.012(2)(3) 0.300±0.019(2) 0.709±0.014(2)(3)(4) 0.215±0.014(2)TrkA 1.603±0.029 1.603±0.018 0.067±0.011(1) 0.874±0.032(2)(3) 0.502±0.009(2) 0.878±0.022(2)(3)(4) 0.136±0.021(2)TrkB 3.013±0.013 3.010±0.019 0.298±0.016(1) 1.204±0.021(2)(3) 0.904±0.017(2) 1.197±0.022(2)(3)(4) 0.596±0.008(2)GFR-α1 2.513±0.013 2.520±0.010 0.153±0.011(1) 0.902±0.009(2)(3) 0.743±0.010(2) 0.892±0.009(2)(3)(4) 0.301±0.009(2)Ret 1.202±0.011 1.194±0.014 0.165±0.009(1) 0.914±0.011(2)(3) 0.602±0.020(2) 0.918±0.013(2)(3)(4) 0.315±0.013(2)TH 1.058±0.035 1.053±0.021 0.145±0.011(1) 0.813±0.019(2)(3) 0.581±0.019(2) 0.816±0.024(2)(3)(4) 0.410±0.012(2)

圖1 復(fù)方地黃顆粒對(duì)PD模型大鼠損毀側(cè)紋狀體相關(guān)因子及黑質(zhì)、紋狀體TH的蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of compound Rehmannia granule on the expression levels of related factors of lesioned striatum and TH of substantia nigra in PD model rats

3 討 論

PD病在筋脈，與肝、脾、腎等臟關(guān)系密切。基本病機(jī)為肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，筋脈失養(yǎng)。本課題組提出“滋腎平肝、化痰活血、解毒散結(jié)”諸法合用是其治療法則[8]。據(jù)此立法組方，結(jié)合古、現(xiàn)代醫(yī)家治療PD應(yīng)用較多的中藥和方劑，并繼承名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)，研制出治療PD的中藥復(fù)方——復(fù)方地黃顆粒[9]。方由熟地黃、白芍、鉤藤、珍珠母、丹參、石菖蒲、全蝎組成。方中熟地性溫味甘，歸肝腎經(jīng)，善補(bǔ)益腎精、滋陰養(yǎng)血、固本培元，故為君藥；鉤藤甘涼，入肝心經(jīng)，功效熄風(fēng)定驚、化痰舒筋；珍珠母性味咸寒，歸肝心經(jīng)，可滋陰潛陽(yáng)、定驚止顫、養(yǎng)血舒筋，柔肝與熄風(fēng)兩者兼顧，滋陰與養(yǎng)血并療，乃平肝潛陽(yáng)之要藥；白芍性味苦酸微寒，歸肝脾經(jīng)，養(yǎng)肝血、滋肝陰、柔肝氣，為養(yǎng)血濡筋、緩急止顫之良藥，與鉤藤、珍珠母同用，可助君藥滋陰養(yǎng)血、熄風(fēng)平肝，共為臣藥；丹參味苦，微寒，歸心、心包、肝經(jīng)，功效養(yǎng)血、活血、化瘀；石菖蒲辛苦溫，歸心胃經(jīng)，功效化痰除濕、開竅醒神，共為佐藥；全蝎辛平有毒，歸肝經(jīng)，集解毒熄風(fēng)、化痰祛瘀、通絡(luò)散結(jié)于一體，為使藥。上述諸藥合用，可滋補(bǔ)肝腎、活血化痰、散結(jié)解毒。

在PD動(dòng)物模型研發(fā)中，大鼠對(duì)6-OHDA相對(duì)敏感[10]，6-OHDA致PD大鼠模型是目前應(yīng)用最多的動(dòng)物模型之一，可引起大鼠黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性死亡，乃至缺失，DA含量降低；黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)TH活性減弱。造模成功后，大鼠出現(xiàn)不同程度的運(yùn)動(dòng)功能障礙和震顫[11]，與PD患者臨床癥狀有高度相似之處。本研究選擇SD大鼠成功制備了陰虛動(dòng)風(fēng)證PD模型[4,12]，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

NTFs是一組促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育、導(dǎo)向和功能維持所必須的因子，最有代表性的是NGF、BDNF和GDNF三大類，其中NGF具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元和促進(jìn)突起生長(zhǎng)的功能，BDNF有助于黑質(zhì)DA能神經(jīng)元分化和存活，GDNF對(duì)DA能神經(jīng)元有特異性的營(yíng)養(yǎng)作用[13]。NGF的受體是TrkA，BDNF的受體是TrkB，GDNF的受體是GFR-α1，Ret蛋白是GDNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。TH可在DA能神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)催化酪氨酸形成L-DOPA，L-DOPA經(jīng)芳香簇氨基酸脫羧酶催化形成DA。TH是DA生物合成的限速酶，該酶在黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)中質(zhì)(活性)和量(表達(dá))的變化會(huì)直接影響到L-DOPA的合成，與PD的發(fā)病密切相關(guān)[14]。

在本研究中，與模型組比較，美多芭組及復(fù)方地黃顆粒各劑量組大鼠的NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret、TH mRNA及蛋白的表達(dá)升高(P＜0.01)，提示復(fù)方地黃顆粒對(duì)PD的治療作用是通過改善NTFs及其受體的途徑實(shí)現(xiàn)的；與復(fù)方地黃顆粒低劑量及高劑量組比較，美多芭組及復(fù)方地黃顆粒中劑量組的上述NTFs及其受體、TH的mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，提示中劑量復(fù)方地黃顆粒的療效最佳；與美多芭組相比較，復(fù)方地黃顆粒中劑量組NTFs及受體、TH的mRNA及蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明中劑量復(fù)方地黃顆粒與西藥美多芭的療效相當(dāng)。

綜上所述，復(fù)方地黃顆粒對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的陰虛動(dòng)風(fēng)證PD模型大鼠有較明顯的DA能神經(jīng)元保護(hù)作用。在復(fù)方地黃顆粒各劑量組中，以中劑量組的療效最好，可為今后該復(fù)方的毒理學(xué)試驗(yàn)提供劑量參考。