復(fù)方地黃顆粒和毛蕊花糖苷治療帕金森病模型大鼠的作用靶標(biāo)研究

梁建慶，何建成

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是好發(fā)于中老年人的中樞神經(jīng)退行性疾病，其主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergic neuron)退行性變，黑質(zhì)-紋狀體多巴胺(dopamine，DA)減少，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)活性下降。目前，PD的防治藥物主要是左旋多巴，但長(zhǎng)期服用可引起異動(dòng)癥[1]。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方地黃顆粒及其主要成分毛蕊花糖苷治療PD有效?；诖耍狙芯拷D大鼠模型[2]，探討復(fù)方地黃顆粒和毛蕊花糖苷治療該病的作用靶標(biāo)，為新型PD治療藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物及試劑 復(fù)方地黃顆粒由熟地黃、白芍、鉤藤、珍珠母、丹參、石菖蒲、全蝎等組成(上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑實(shí)驗(yàn)室提供)，使用前用蒸餾水稀釋成灌胃液；毛蕊花糖苷由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑實(shí)驗(yàn)室提供。戊巴比妥鈉(上海中西藥業(yè)股份有限公司)；慶大霉素(上海第一制藥廠，0.3g/支)；美多芭(上海羅氏制藥公司，0.25g/片)；6-羥基多巴胺(6-OHDA)、阿撲嗎啡(APO)、抗壞血酸、谷氨酸(GLU)、天門(mén)冬氨酸(ASP)、甘氨酸(GLY)、γ-氨基丁酸(GABA)標(biāo)準(zhǔn)品及優(yōu)級(jí)純高絲氨酸(HSE)標(biāo)準(zhǔn)品、優(yōu)級(jí)純鄰苯二甲醛(OPA，Sigma公司，美國(guó))；GoTaq? qPCR 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega公司，美國(guó))；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；TH抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))；即用型快捷免疫組化鼠Max VisionTM試劑盒(邁新生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 TOW-3A型大鼠腦立體定位儀(廣東汕頭市教育醫(yī)學(xué)儀器廠)；ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司)；RNA/DNA calculator(Pharmacia公司)；高效液相色譜儀：Shimadzu，LC-20AB二元高壓泵，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，RF-10AXL熒光檢測(cè)器，CTO-10AVP柱溫箱(日本島津公司)；色譜柱：Kromasil C18，250.0mm×4.6mm，5μm(美國(guó)Sigma公司)；CUT4060石蠟切片機(jī)(斯沃德(北京)儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立 雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重180～200g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SYXK(滬)2008-0016)。實(shí)驗(yàn)條件：恒溫(23±2)℃，相對(duì)濕度60%～65%，自動(dòng)光-暗控制(7:00～19:00光照，19:00～7:00暗置)，動(dòng)物攝食、飲水及活動(dòng)自由。PD模型的制備采用Ungerstedt等[3]所創(chuàng)立的經(jīng)典方法。手術(shù)前進(jìn)行常規(guī)行為測(cè)試，確認(rèn)大鼠無(wú)異常旋轉(zhuǎn)行為后，用3%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉。將麻醉大鼠固定在大鼠腦立體定位儀上，無(wú)菌條件下暴露前囟和后囟，保證大鼠前囟和后囟在同一水平線上。根據(jù)包新民等[4]編著的大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為準(zhǔn)，確定右側(cè)黑質(zhì)二點(diǎn)坐標(biāo)：①前囟后5.2mm，正中線右側(cè)1.0mm，硬膜下9.0mm；②前囟后5.2mm，正中線右側(cè)2.5mm，硬膜下8.5mm。用顱骨鉆于手術(shù)要求部位小心鉆開(kāi)顱骨，用5μl微量進(jìn)樣器將6-OHDA(溶于含0.2%維生素C的生理鹽水中)先后注入(以1.0mm/min速度緩慢進(jìn)針，注射速度為1μl/min)右側(cè)黑質(zhì)二點(diǎn)坐標(biāo)處，每孔3μl，注射完畢后留針5min，然后以1.0mm/min速度緩慢退針。手術(shù)完成后，用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔，縫合切口處皮膚，肌內(nèi)注射慶大霉素7d。造模10d后，以腹腔注射APO 0.5mg/kg誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開(kāi)始旋轉(zhuǎn)后30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均＞7次/min者為合格的PD模型[5]。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將造模成功的72只大鼠分層隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為模型組(Model組)、美多芭組(Madopar組，150mg/kg)、毛蕊花糖苷組(Verba組，60mg/kg)、復(fù)方地黃顆粒低劑量組(LCRG組，3.5g/kg)、復(fù)方地黃顆粒中劑量組(MCRG組，7.0g/kg)、復(fù)方地黃顆粒高劑量組(HCRG組，14.0g/kg)；另設(shè)正常對(duì)照組(NC組，只捆綁動(dòng)物，不作其他處理)和假手術(shù)組(SO組，只注射含0.2%維生素C的生理鹽水)。大鼠每日給藥量按孫瑞元[6]的方法計(jì)算。復(fù)方地黃顆粒、毛蕊花糖苷和美多芭分別用蒸餾水溶解，每天灌胃1次。正常對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組以等體積蒸餾水(2ml/只)灌胃，連續(xù)用藥6周。

1.5 大鼠右側(cè)紋狀體N-甲基-D-天冬氨酸受體1(NMDA-R1)、NMDA-R2、γ-氨基丁酸β1受體(GABA-RB1) mRN水平的測(cè)定 采用RT-PCR法檢測(cè)NMDA-R1、NMDA-R2、GABA-RB1 mRNA水平。每組6只大鼠斷頭取腦，小心分離右側(cè)紋狀體并稱重。抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增。引物序列見(jiàn)表1；PCR條件為：94℃預(yù)變性1min，94℃ 8s，60℃34s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。采用相對(duì)定量2–ΔΔCt法分析各個(gè)樣本目的基因的表達(dá)變化。

表1 大鼠右側(cè)紋狀體NMDA-R1、NMDA-R2、GABA-RB1引物序列Tab.1 Primer sequences of NMDA-R1,NMDA-R2 and GABA-RB1 in right striatum of rats

1.6 大鼠右側(cè)紋狀體ASP、GLU、GLY、GABA含量的HPLC測(cè)定

1.6.1 腦組織勻漿液的制備 ①取大鼠右側(cè)紋狀體置于勻漿管中，以1:10的比例加入0.4mol/L的高氯酸，冰浴下充分勻漿；②冰浴沉淀30min，于4℃、10 000r/min離心15min；③取上清液并每1ml加入0.1mol/L NaHCO3溶液1ml，混勻后于4℃、3000r/min離心5min，取上清液待測(cè)。

1.6.2 試劑配制 精確配置GLU、ASP、GLY、GABA及內(nèi)標(biāo)HSE的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液1mmol/L，分析時(shí)用超純水稀釋成工作液。精密稱取27mg OPA，加入0.5ml甲醇溶解，加入20μl β-巰基乙醇，再用硼酸(pH 9.5)0.4mol/L定容至5ml，避光0～4℃保存。隔日補(bǔ)加β-巰基乙醇10～15μl，共1周。

1.6.3 色譜條件與檢測(cè)方法 色譜柱：Kromasil-C18，4.6mm×250.0mm，5μm。流動(dòng)相：A為0.1mol/L乙酸鈉溶液(pH6.3)和0.05%四氫呋喃，B為100%甲醇。柱溫30℃。檢測(cè)時(shí)腦組織勻漿液稀釋250倍，取稀釋液37μl加入濃度為0.2μmol/L的內(nèi)標(biāo)高絲氨酸溶液3μl，然后加20μl OPA衍生試劑，漩渦混勻30s，靜置80s，精確控制在2min時(shí)進(jìn)樣20μl進(jìn)行氨基酸測(cè)定。

1.7 大鼠右側(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定 每組6只大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉后進(jìn)行心臟灌注，分離右側(cè)黑質(zhì)部分，置4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)大鼠右側(cè)黑質(zhì)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后，檢測(cè)TH陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。鏡下觀察，每組觀察6張切片，每張切片在光鏡高倍鏡下隨機(jī)取3個(gè)4mm2視野，計(jì)算TH陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)。分析軟件使用IMS彩色圖像分析系統(tǒng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，方差齊者，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠右側(cè)紋狀體NMDA-R1、NMDA-R2、GABA-RB1 mRNA水平的變化 與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)NMDA-R1、NMDA-R2 mRNA表達(dá)明顯升高，GABA-RB1 mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。復(fù)方地黃顆粒及毛蕊花糖苷干預(yù)后，NMDA-R1、NMDA-R2 mRNA表達(dá)較模型組呈降低趨勢(shì)，GABA-RB1 mRNA表達(dá)較模型組呈升高趨勢(shì)，以復(fù)方地黃顆粒中劑量組改善最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表2)。

2.2 大鼠右側(cè)紋狀體ASP、GLU、GLY、GABA含量的變化 與正常對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)ASP、GLU含量明顯升高，GLY、GABA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。復(fù)方地黃顆粒及毛蕊花糖苷干預(yù)后，ASP、GLU含量較模型組呈降低趨勢(shì)，GLY、GABA含量較模型組呈升高趨勢(shì)，以復(fù)方地黃顆粒中劑量組改善最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表3)。

2.3 大鼠右側(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的變化 鏡下觀察可見(jiàn)，TH陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)，在正常對(duì)照組、假手術(shù)組的右側(cè)黑質(zhì)均可見(jiàn)密集的TH 陽(yáng)性細(xì)胞，呈棕褐色，細(xì)胞形狀主要為圓形或卵圓形，少數(shù)呈多邊形；模型組右側(cè)黑質(zhì)可見(jiàn)少量、稀疏分布的TH陽(yáng)性細(xì)胞；隨著給藥干預(yù)，TH陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量有所增加(圖1)。

表2 大鼠右側(cè)紋狀體NMDA-R1、NMDA-R2、GABA-RB1 mRNA的表達(dá)水平(±s，n=6)Tab.2 Levels of NMDA-R1,NMDA-R2 and GABA-RB1 mRNA in right striatum of rats (±s,n=6)

表2 大鼠右側(cè)紋狀體NMDA-R1、NMDA-R2、GABA-RB1 mRNA的表達(dá)水平(±s，n=6)Tab.2 Levels of NMDA-R1,NMDA-R2 and GABA-RB1 mRNA in right striatum of rats (±s,n=6)

NMDA.N-methyl-D-aspartic acid receptor; GABA.γ-aminobutyric acid; NC.Normal control; SO.Sham operation; LCRG.Low dose group of compound Rehmannia granules; MCRG.Medium dose group of compound Rehmannia granules; HCRG.High dose group of compound Rehmannia granules; (1)P＜0.01 compared with NC group and SO group; (2)P＜0.01 compared with Model group; (3)P＜0.01 compared with LCRG group and HCRG group

Group NMDA-R1 NMDA-R2 GABA-RB1 NC 0.030±0.006 0.915±0.015 1.065±0.086 SO 0.030±0.003 0.917±0.042 1.068±0.093 Model 0.112±0.009(1) 2.146±0.062(1) 0.204±0.099(1)Madopar 0.049±0.003(2) 1.048±0.019(2) 0.818±0.031(2)Verba 0.067±0.011(2) 1.199±0.037(2) 0.696±0.049(2)LCRG 0.069±0.005(2) 1.201±0.043(2) 0.674±0.053(2)MCRG 0.047±0.007(2)(3) 1.042±0.055(2)(3) 0.833±0.073(2)(3)HCRG 0.082±0.004(2) 1.346±0.067(2) 0.538±0.082(2)

表3 大鼠右側(cè)紋狀體ASP、GLU、GLY、GABA含量比較(μmol/g，±s，n=6)Tab.3 Contents of ASP,GLU,GLY and GABA in right striatum of rats (μmol/g,±s,n=6)

表3 大鼠右側(cè)紋狀體ASP、GLU、GLY、GABA含量比較(μmol/g，±s，n=6)Tab.3 Contents of ASP,GLU,GLY and GABA in right striatum of rats (μmol/g,±s,n=6)

GABA.γ-aminobutyric acid; NC.Normal control; SO.Sham operation; LCRG.Low dose group of compound Rehmannia granules; MCRG.Medium dose group of compound Rehmannia granules; HCRG.High dose group of compound Rehmannia granules; (1)P＜0.01 compared with NC group and SO group; (2)P＜0.01 compared with Model group; (3)P＜0.01 compared with LCRG group and HCRG group

Group ASP GLU GLY GABA NC 1.5982±0.2304 6.1257±0.6214 4.1267±0.1945 4.8682±0.8395 SO 1.6023±0.2375 6.0959±0.5684 4.2105±0.2014 4.8519±0.9542 Model 4.0120±0.1874(1) 14.8526±0.6147(1) 1.0050±0.3001(1) 1.2004±1.0002(1)Madopar 2.0160±0.1945(2) 7.4987±0.5894(2) 3.7981±0.1874(2) 4.4981±0.7998(2)Verba 2.6020±0.2147(2) 9.8652±0.5968(2) 3.2104±0.2224(2) 3.7395±0.8874(2)LCRG 2.5940±0.2258(2) 9.9854±0.6042(2) 3.1248±0.2453(2) 3.7453±0.8953(2)MCRG 2.0130±0.2019(2)(3) 7.5486±0.5784(2)(3) 3.8874±0.2648(2)(3) 4.5214±0.9454(2)(3)HCRG 3.3350±0.2195(2) 12.5684±0.6201(2) 2.8456±0.1994(2) 2.0476±0.8423(2)

圖1 大鼠右側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞變化的免疫組化檢測(cè)(×400)Fig.1 Changes of TH positive cells in right substantia nigra of rats (Immunohistochemistry,×400)

與正常對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠右側(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。復(fù)方地黃顆粒及毛蕊花糖苷干預(yù)后，TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組升高，以復(fù)方地黃顆粒中劑量組改善最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖2)。

圖2 大鼠右側(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的變化(n=6)Fig.2 Changes in the number of TH positive cells in right substantia nigra of rats (n=6)

3 討 論

大腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)非常豐富，大致可分為氨基酸類(lèi)、單胺類(lèi)和多肽類(lèi)，本實(shí)驗(yàn)主要研究氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)。作為腦內(nèi)一類(lèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，根據(jù)其對(duì)突觸后神經(jīng)元的興奮與抑制作用，氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)分為興奮性與抑制性兩種，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)包括GLU和ASP，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)包括GLY和GABA。GLU受體是NMDA-R1、NMDA-R2，GABA受體是GABA-RB1。神經(jīng)遞質(zhì)與突觸后膜受體結(jié)合，使突觸后膜興奮或抑制。在病理情況下，興奮性氨基酸及其受體介導(dǎo)的興奮毒性在PD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)在PD大鼠黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)含量過(guò)高，與其受體結(jié)合時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，引起突觸后膜的過(guò)度興奮，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，使神經(jīng)系統(tǒng)缺血、神經(jīng)紊亂、神經(jīng)退行性變，可導(dǎo)致DA神經(jīng)元受損并最終壞死，這種神經(jīng)元死亡過(guò)程被稱為興奮毒性作用。與此相反，抑制性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其受體在黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)含量增加，引起突觸后膜的過(guò)度抑制，有利于維持神經(jīng)遞質(zhì)合成與失活的動(dòng)態(tài)平衡，遏制興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的興奮毒性作用，對(duì)DA神經(jīng)元可起到防御保護(hù)作用[7]。DA水平降低是PD患者運(yùn)動(dòng)功能障礙的直接原因。TH是DA合成的限速酶，從源頭上補(bǔ)充DA的合成酶TH，能增加DA神經(jīng)元功能，提高PD患者運(yùn)動(dòng)能力[8]。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，PD模型組大鼠興奮性神經(jīng)遞質(zhì)GLU、ASP含量升高，GLU的受體NMDA-R1、NMDA-R2 mRNA表達(dá)水平升高；抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GLY、GABA的含量下降，GABA的受體GABA-RB1 mRNA表達(dá)水平下降(P＜0.01)；TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯降低(P＜0.01)。給予復(fù)方地黃顆粒和毛蕊花糖苷干預(yù)后，GLU、ASP含量下降，GLU的受體NMDA-R1、NMDA-R2 mRNA表達(dá)水平下降；抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GLY、GABA含量升高，GABA的受體GABA-RB1 mRNA表達(dá)水平升高(P＜0.01)；TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯升高(P＜0.01)?？梢?jiàn)復(fù)方地黃顆粒和毛蕊花糖苷能使抑制性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其受體在黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)含量增加，興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其受體在黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)含量下降，遏制興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的興奮毒性作用，對(duì)DA神經(jīng)元可起到防御保護(hù)作用。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，PD的病機(jī)是肝腎虧虛、陰虛動(dòng)風(fēng)，治宜培補(bǔ)肝腎、滋陰熄風(fēng)。復(fù)方地黃顆粒方中熟地補(bǔ)腎益精，滋陰養(yǎng)血為君藥；鉤藤熄風(fēng)定驚，珍珠母滋陰潛陽(yáng)，白芍滋肝陰，共為臣藥；丹參養(yǎng)血，石菖蒲開(kāi)竅醒神，全蝎熄風(fēng)，共為佐使藥[9-10]。毛蕊花糖苷別名麥角甾苷、毛蕊花苷，屬于苯丙素苷類(lèi)化合物，分子式C29H36O15，分子量624.59，是熟地中的主要有效成分，報(bào)道稱可保護(hù)中樞神經(jīng)元[11-12]。

上述研究結(jié)果表明，PD動(dòng)物模型中復(fù)方地黃顆粒和毛蕊花糖苷的作用靶標(biāo)可能在于氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其受體基因，以及DA能神經(jīng)元的保護(hù)。其中以復(fù)方地黃顆粒中劑量組發(fā)揮治療作用最顯著，毛蕊花糖苷組有一定的治療作用，但較復(fù)方中劑量組治療效果弱。本研究應(yīng)用RT-PCR、HPLC和免疫組化的方法探討了復(fù)方地黃顆粒和毛蕊花糖苷的作用靶標(biāo)，這一研究成果使得復(fù)方地黃顆粒和毛蕊花糖苷有希望用于治療神經(jīng)退行性疾病，尤其是PD，可以增強(qiáng)神經(jīng)可塑性，促進(jìn)神經(jīng)元再生。然而，PD往往涉及多種復(fù)雜機(jī)制，因此復(fù)方地黃顆粒和毛蕊花糖苷是否還通過(guò)其他靶標(biāo)如生物分子或信號(hào)網(wǎng)絡(luò)等發(fā)揮治療作用，仍須更多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究予以驗(yàn)證。