動(dòng)物神經(jīng)性疾病相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

羅蓀琳 ， 范瑞祺， ， 張婉君， ， 賈 栗 ， 苑曉燕 ， 陳義強(qiáng)

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 北京 海淀 100193 ；2.中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制中心 ， 北京 豐臺(tái) 100171)

神經(jīng)遞質(zhì)是機(jī)體中神經(jīng)信號(hào)傳遞的內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能。動(dòng)物神經(jīng)性疾病(如癲癇)的發(fā)生往往伴隨著神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，并且神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的藥物開發(fā)(如麻醉劑)與外源性化合物(如有機(jī)磷農(nóng)藥)對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)毒性研究中通常以神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化作為檢測(cè)指標(biāo)，因此在獸醫(yī)領(lǐng)域神經(jīng)遞質(zhì)的定量測(cè)定是十分重要的。

根據(jù)神經(jīng)遞質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)，可將其分為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)和肽類神經(jīng)遞質(zhì)等(表1)。不同種類神經(jīng)遞質(zhì)化學(xué)特性不同，適用的檢測(cè)方法也不盡相同。神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)常需要分離技術(shù)和檢測(cè)方法聯(lián)用測(cè)定，前者常用方法主要是色譜法和毛細(xì)管電泳法，后者主要儀器包括質(zhì)譜檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和紫外可見檢測(cè)器等[1]。本文總結(jié)了近年來(lái)與動(dòng)物神經(jīng)性疾病發(fā)生密切相關(guān)的四類神經(jīng)遞質(zhì)(單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)和肽類神經(jīng)遞質(zhì))的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展，以期為獸醫(yī)神經(jīng)性疾病臨床診療和藥物開發(fā)提供一定幫助。

表1 神經(jīng)遞質(zhì)分類

1 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括兒茶酚胺和吲哚胺類，前者主要包含多巴胺(Dopamine,DA)、去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)和腎上腺素(Epinephrine,E)，后者主要包括5-羥色胺(Serotonin,5-HT)和5-羥基色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)，參與記憶、睡眠、感覺傳遞等生理過程[2-3]以及獸藥噻拉嗪等的作用途徑[4]。常見單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 常見單胺類神經(jīng)遞質(zhì)分子式

液相色譜法是測(cè)定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的最常用方法，在使用反相液相色譜時(shí)，由于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)具有強(qiáng)極性，在色譜柱上保留時(shí)間短，需要通過衍生化處理改善單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的色譜保留行為[5]，如以苯甲酰氯[6]作為衍生化試劑的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。親水相互作用色譜可替代反相液相色譜，Konieczna等[7]建立了分散液-液微萃取的液相色譜-親水相互作用色譜-質(zhì)譜方法測(cè)定單胺神經(jīng)遞質(zhì)及其各自的前體和代謝物。為適應(yīng)不同樣品中神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)，Li等[8]建立了苯硼酸輔助的雙功能固相萃取結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)尿中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的臨床常規(guī)檢測(cè)。Fuertig等[9]加入氘代內(nèi)標(biāo)，無(wú)需衍生即可通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量分析包括DA、5-HT等在內(nèi)的11種物質(zhì)。盡管許多研究使用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與高效液相色譜聯(lián)用的檢測(cè)器不同時(shí)，檢測(cè)效果存在差異。一項(xiàng)研究分別使用高效液相色譜與紫外、熒光和質(zhì)譜檢測(cè)器聯(lián)用，測(cè)定小鼠不同腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，結(jié)果顯示使用熒光檢測(cè)器的檢測(cè)結(jié)果更好，定量限低且基質(zhì)效應(yīng)弱[10]。這說(shuō)明不同樣品中神經(jīng)遞質(zhì)的最優(yōu)檢測(cè)方法不同，一種檢測(cè)方法的建立無(wú)法適用于所有檢測(cè)樣品，需要針對(duì)不同物種、不同樣品基質(zhì)等條件分別建立合適的檢測(cè)方法。另外，微透析活體采樣技術(shù)也廣泛用于體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，但微透析取樣后的樣品量少，如何能使用少量樣品準(zhǔn)確定量神經(jīng)遞質(zhì)含量也是一個(gè)挑戰(zhàn)。Carreo等[11]建立了一種用于微透析樣品中DA、5-HT等定量分析的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，該方法精密度和檢測(cè)限均能滿足測(cè)定要求。

2 膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)

乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)是最主要的膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)，由膽堿和乙酰輔酶A在膽堿乙酰移位酶的催化作用下合成，參與記憶、學(xué)習(xí)和認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)、攝食、壓力等生理過程[12]，與動(dòng)物熱應(yīng)激、麻醉藥物作用發(fā)揮等[13-14]有重要聯(lián)系。ACh的分子結(jié)構(gòu)式見圖2。

圖2 乙酰膽堿分子式

ACh同樣可用色譜法進(jìn)行測(cè)定，如液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)血漿[15]以及大鼠不同腦區(qū)[16]ACh含量進(jìn)行測(cè)定。色譜法測(cè)定ACh的難點(diǎn)在于內(nèi)源性化合物γ-丁酰甜菜堿與ACh結(jié)構(gòu)相似，容易干擾ACh的測(cè)定。Lamy等[17]建立了一種高靈敏度親水相互作用色譜-質(zhì)譜方法，可有效分離ACh與γ-丁酰甜菜堿。

此外，還可使用傳感器法[18]和熒光探針[19]測(cè)定ACh。傳感器檢測(cè)技術(shù)研究不斷尋求新的材料構(gòu)建生物傳感器，Chauhan等[20]建立了將乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶固定在改性氟摻雜氧化錫上構(gòu)成的生物傳感器，用于測(cè)定血清樣品中的ACh水平，該方法具有較高的靈敏度和較低的檢測(cè)限。近年來(lái)單獨(dú)檢測(cè)ACh的方法建立較少，大多建立的新方法是用于ACh與其他種類神經(jīng)遞質(zhì)共同檢測(cè)，如液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嚙齒動(dòng)物腦脊液中[21]和大鼠腦中[22]ACh與多種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)。

3 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)

氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)種類較多，包括谷氨酸(Glutamate,Glu)、γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid,GABA)、谷氨酰胺(Glutamine,Gln)、甘氨酸(Glycine,Gly)等，此類神經(jīng)遞質(zhì)參與調(diào)節(jié)情緒、感知傳遞等生理過程[2]，與動(dòng)物癲癇[23]、肝性腦病[24]等疾病相關(guān)[25-27]。常見氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖3 常見氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)分子式

氨基酸測(cè)定即可直接使用氨基酸分析儀進(jìn)行樣本中游離氨基酸批量測(cè)定[28]，一般多用高效液相色譜法檢測(cè)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì),但氨基酸分子結(jié)構(gòu)小,且大多沒有光學(xué)性質(zhì),因此一般先將其衍生化,再利用色譜法進(jìn)行分析，即柱前衍生[29]。常用的衍生劑有鄰苯二甲醛[29]、異硫氰酸苯酯[30]等。測(cè)定氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)時(shí)色譜常與熒光檢測(cè)器聯(lián)用，Cui等[31]開發(fā)了一種高效液相色譜-熒光法測(cè)定抑郁大鼠腦組織7種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量；Li等[32]通過高效液相色譜-熒光檢測(cè)器結(jié)合鄰苯二甲醛衍生定量檢測(cè)小鼠腦缺血后大腦皮層和血漿中的18種氨基酸；Huang等[33]建立了高效液相色譜-熒光法同時(shí)測(cè)定糖尿病大鼠皮質(zhì)和海馬中與糖尿病腦病發(fā)病機(jī)制相關(guān)的9種神經(jīng)遞質(zhì)。許多文獻(xiàn)通過液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)。Yan等[34]通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大鼠腦中的5種神經(jīng)遞質(zhì)，用于研究刺槐水提物對(duì)失眠大鼠模型的催眠作用。使用4′-碳酰氯玫瑰胺作為衍生試劑，基于原位超聲輔助衍生化分散液-液微萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，可分析阿爾茨海默病大鼠尿液中的氨基酸和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物[35]。液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合微透析可實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠突觸間隙中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平的同步檢測(cè)[36]。毛細(xì)管電泳也適用于手性氨基酸拆分和復(fù)雜樣品中的氨基酸分析[37]，結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，在鄰苯二甲醛衍生下用熒光硫醇快速標(biāo)記氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)可進(jìn)行高通量分析[38]。

4 肽類神經(jīng)遞質(zhì)

肽類神經(jīng)遞質(zhì)包括谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、內(nèi)源性阿片肽(Endogenous opioid peptides,EOP)和腦啡肽(Enkephalin,ENK)等，參與睡眠、情緒調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶等生理過程，與犬脊髓損傷[39]等動(dòng)物疾病發(fā)生有關(guān)。常見肽類神經(jīng)遞質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)式見圖4。

圖4 常見肽類神經(jīng)遞質(zhì)分子式

早期的肽類物質(zhì)含量測(cè)定多采用免疫親和法，隨著聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，液相色譜結(jié)合微透析法檢測(cè)肽類的方法逐漸豐富，近年來(lái)這些方法還在不斷改進(jìn)，Wilson等[40]使用同位素內(nèi)標(biāo)建立毛細(xì)管液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)大鼠海馬中神經(jīng)肽進(jìn)行定量分析；Al-Hasani等[41]開發(fā)了一種光遺傳性微透析探針結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法用于測(cè)定阿片肽等神經(jīng)遞質(zhì)含量。此外，肽類神經(jīng)遞質(zhì)的活體原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)可采用電化學(xué)法(如快速掃描循環(huán)伏安法[42])進(jìn)行。

總結(jié)與展望

神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)系統(tǒng)的信使，將神經(jīng)中樞的信號(hào)傳至各個(gè)組織和器官，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，在神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定中色譜與質(zhì)譜聯(lián)用方法不斷改進(jìn)，尤其是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。活體采樣微透析法、電化學(xué)法以及各種傳感器技術(shù)都有不同程度的發(fā)展，各種小分子物質(zhì)被嘗試用作生物探頭，如納米材料、熒光材料。許多研究證明，神經(jīng)性病變往往是多種神經(jīng)遞質(zhì)濃度改變的綜合結(jié)果，因此多神經(jīng)遞質(zhì)的同步測(cè)定方法亟需建立。為滿足獸醫(yī)領(lǐng)域神經(jīng)遞質(zhì)定量分析需求，未來(lái)亟需發(fā)展活體原位實(shí)時(shí)測(cè)定的高靈敏度、高通量多神經(jīng)遞質(zhì)同步測(cè)定方法。