豬細小病毒6型研究進展

張鑫杰 ， 薛少華 ， 呂紫欣 ， 戴愛玲,2,3 ， 楊小燕,2,3

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 , 福建 龍巖 364012 ； 2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心 ， 福建 龍巖 364000 ；3.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室 ， 福建 龍巖 364000)

豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是造成母豬繁殖障礙的重要致病原之一，并在世界范圍內(nèi)廣泛流行，感染后可造成豬的死木胎綜合征(Stillbirth,mummification,embryonic death and infertility,SMEDI),即母豬產(chǎn)死胎、木乃伊胎、胚胎發(fā)育不良和死亡及母豬不孕等[1]。PPV在臨床上常與豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等病原產(chǎn)生共感染并引發(fā)豬的免疫抑制，給豬場帶來巨大的經(jīng)濟損失[2]。

1965年，PPV1首次分離于德國[3]，被認為是引起世界范圍內(nèi)豬繁殖障礙的主要原因之一，且經(jīng)常與PCV-2混合感染，共同引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)[4]。據(jù)文獻報道，PPV2于2001年在緬甸發(fā)現(xiàn)[5]，且臨床調(diào)查顯示PPV2與PCV-2具有較高的共感染率，并且其病毒載量和抗體水平的變化與臨床體征的出現(xiàn)密切相關(guān)，表明PPV2可能與PCVAD和呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)[6-7]。PPV3與PPV4分別首次發(fā)現(xiàn)于香港和美國北卡羅來納州，二者均被發(fā)現(xiàn)與PCV-2具有較高的共感染率，可能與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)有關(guān)[8-10]。2014年，Ni等從流產(chǎn)胎兒的組織樣品中鑒定出PPV6，并且該組織樣品中不包含偽狂犬病毒(PRV)、PRRSV、PPV1、PCV2、豬瘟病毒(CSFV)、豬流感病毒(SIV)和布魯氏菌[11]，表明PPV6可能與豬繁殖障礙有關(guān)。隨后，Schirtzinger等在美國的PRRSV陽性樣品中發(fā)現(xiàn)PPV6[12]。并且有研究報道指出，PPV6還與仔豬的豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)具有顯著相關(guān)性[13]。2016年，Palinski等首次在美國健康成年豬的肛拭子中發(fā)現(xiàn)PPV7[14]。隨后在中國、波蘭、韓國、瑞典和巴西等多個國家均發(fā)現(xiàn)PPV7的存在[15]，并且有研究發(fā)現(xiàn)PPV7在流產(chǎn)胎兒組織中檢出率為24.0%，表示其可能與母豬繁殖障礙有關(guān)[16]。

目前在中國、北美、韓國、歐洲均發(fā)現(xiàn)PPV6的流行，提示PPV6具有全球流行的潛力。本文就PPV6的病原學(xué)、遺傳變異特征、分布及流行情況、致病性和診斷方法作綜述，以期為后續(xù)研究的開展提供參考。

1 病原學(xué)

1.1 分類 根據(jù)國際病毒分類委員會(ICTV)2019年7月公布的分類[17]，細小病毒科(Parvoviridae)可分為感染脊椎動物的Parvovirinae和Hamaparvovirinae及感染無脊椎動物的Densovirinae。細小病毒亞科又分為10個屬，包括Protoparvovirus、Amdoparvovirus、Aveparvovirus、Bocaparvovirus、Dependoparvovirus、Erythroparvovirus、Copiparvovirus、Tetraparvovirus、Artiparvovirus和Loriparvovirus。目前PPV1歸類于Protoparvovirus，PPV2和PPV3歸類于Tetraparvovirus，PPV4、PPV5和PPV6歸類于Copiparvovirus，而PPV7歸類于Hamaparvovirinae的Chaphamaparvovirus。具體分類信息可參考http://talk.ictvonline.org/taxonomy/。

1.2 基因組結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)功能 PPV為單股線性DNA病毒，無囊膜，基因組大小為4～6 kb[18]。PPV6基因組大小約為6.1 kb，與大部分豬細小病毒相同，其包含2個主要的開放閱讀框(ORFs)[11,18]。ORF1編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS，主要調(diào)控病毒基因組的復(fù)制。盡管PPV6與其他豬細小病毒氨基酸同源性較低，但其NS蛋白仍保留細小病毒重要的功能基序，包括復(fù)制啟動子、AAA+解旋酶結(jié)構(gòu)域以及三磷酸核苷(NTP)結(jié)合位點等[11]。ORF2編碼病毒的Cap蛋白，Cap蛋白主要由VP1和VP2組成，部分細小病毒具有VP3。對PPV6 Cap蛋白氨基酸序列進行推測發(fā)現(xiàn)，其可能存在鈣離子結(jié)合環(huán)及PLA2催化基序，二者對病毒的入侵機制、致病性和入核等方面具有重要的調(diào)控作用[19]。VP2通過桿狀病毒表達或原核表達均能夠自組裝成病毒樣顆粒，并具有極強的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生大量中和抗體，是PPV最主要的抗原蛋白[20-21]。與減毒疫苗相比，亞單位疫苗具有安全、易制備的特點。因此，通過表達PPV6 VP2蛋白而自組裝成的病毒樣顆粒，可成為PPV6新型疫苗開發(fā)的手段。另外，PPV4與Bocaparvovirus成員在2個開放閱讀框中間包含1個ORF3，但二者ORF3編碼的蛋白具有很大差異[22]。

1.3 培養(yǎng)特性 由于PPV1在豬腎或睪丸細胞中具有較高的復(fù)制效率，目前常用豬胚腎細胞(ESK)、豬腎細胞(PK-15、SK6)、豬睪丸上皮樣細胞(STE)和豬腎細胞系(SPEV)等細胞系對PPV1進行分離培養(yǎng)[1]。目前通過PK-15、非洲綠猴腎細胞(Vero)和猴胚胎腎上皮細胞(Marc-145)等細胞系對PPV6進行分離的嘗試均未成功[11]。鑒于PCV3感染性克隆的成功構(gòu)建[23]，可以嘗試通過構(gòu)建感染性克隆的方式對PPV6進行病毒拯救。

2 遺傳變異特征

Ni等[11]發(fā)現(xiàn)的5株P(guān)PV6的核苷酸同源性分析顯示，5株P(guān)PV6 全基因組的核苷酸同源性為97.1%～99.6%，NS蛋白及VP1蛋白的氨基酸同源性為97.3%～99.9%。汪偉等[24]對2株廣西PPV6全基因進行核苷酸同源性分析顯示，2株P(guān)PV6與國內(nèi)外參考毒株的NS1核苷酸同源性為99.4%～99.5%，VP1核苷酸同源性為93.0%～99.1%。Schirtzinger等[12]對北美發(fā)現(xiàn)的7株P(guān)PV6的序列對比分析發(fā)現(xiàn)，7株P(guān)PV6ORF1及ORF2的核苷酸同源性分別為99.6%～100.0%和99.3%～99.6%，與Ni等[11]發(fā)現(xiàn)的5株P(guān)PV6的VP1核苷酸同源性為96.8%～99.9%，其中TJ株與北美發(fā)現(xiàn)的毒株親緣關(guān)系最近。上述研究表明，各地域流行毒株之間同源性較高，提示PPV6目前并未發(fā)生明顯變異；中國流行毒株比北美流行毒株變異程度更為明顯，推測PPV6可能更早在中國流行。不同毒株ORF2的同源性更低，表明VP1蛋白比NS蛋白更容易發(fā)生變異。Cui等[25]對波蘭11株P(guān)PV6的核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，11株P(guān)PV6與北美分離株同源性為98.0%～99.8%，與中國分離株同源性為96.4%～98.9%，其中P15-1株與北美分離株KSU7-SD-2014的ORF1同源性為99.9%，而與中國分離株TJ的ORF2同源性為99.9%。該研究表明PPV6不同毒株間可能存在重組現(xiàn)象。

3 分布及流行情況

2014年，Ni等[11]對中國4個省份的PPV6流行情況的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，北京、江蘇、天津和四川均存在PPV6的流行，其中育肥豬及母豬的流行率分別為15.6%和3.8%。2015年，Schirtzinger等[12]首次在北美發(fā)現(xiàn)PPV6，調(diào)查發(fā)現(xiàn)PPV6在血清中的陽性率為13.2%，并且在不同地理位置的抽樣中均發(fā)現(xiàn)其流行(包括美國的9個州及墨西哥的1個州)，表明PPV6已在北美廣泛存在。2017年，Cui等[25]在歐洲首次發(fā)現(xiàn)PPV6的存在，其在波蘭3個豬場中的陽性率為14.9%。另外，F(xiàn)ranzo等[26]首次報道PPV6在西班牙的流行，表明PPV6在歐洲廣泛流行。孫久萌[27]對中國PPV6感染情況的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，PPV6的感染率為31.1%，其在中國的流行可追溯至1993年，流行范圍遍布中國7大地理區(qū)域的20個省市，其中華南地區(qū)感染情況最為嚴重。由于PPV1滅活或減毒疫苗的廣泛使用，PPV1得到有效防控。而PPV6的廣泛流行提示著目前所使用的PPV1滅活或減毒疫苗很難對其產(chǎn)生交叉保護，因此亟需開展現(xiàn)有疫苗對其保護力的研究。

4 致病性

目前對于PPV6感染所致的臨床癥狀及病理機制尚不清楚。根據(jù)Ni等[11]的回顧性調(diào)查，PPV6在流產(chǎn)胎兒及仔豬中的感染率分別達到50%和75%，表明PPV6可能與母豬繁殖障礙有很大關(guān)聯(lián)。有調(diào)查顯示，PPV6可存在于豬的大腦、腎臟、肺臟、肝臟及腸內(nèi)容物[26]，表明PPV6的感染并不存在單一的組織嗜性。Qin等[13]對PRDC相關(guān)病毒群落的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PPV2、PPV3、PPV6均與PRDC顯著相關(guān)，表明PPV6是PRDC潛在的致病因子。

5 診斷方法

對于PPV6的檢測主要可采用PCR、SYBR Green熒光定量PCR、宏基因組測序[28-29]。相比PCR和SYBR Green熒光定量PCR，TaqMan熒光定量PCR檢測方法具有靈敏、準確的優(yōu)點，被運用于大部分分子診斷實驗。因此后期可嘗試建立針對PPV6 的TaqMan熒光定量PCR檢測方法。目前尚未發(fā)現(xiàn)建立血清學(xué)檢測方法的報道。

6 結(jié)語

目前關(guān)于PPV6的流行病學(xué)調(diào)查較少，但已有的研究顯示其可能已在世界范圍內(nèi)廣泛流行。后期需要對病毒的傳播途徑、宿主范圍及易感豬群等作進一步調(diào)查，以填補目前對PPV6流行病學(xué)知識的空白。由于PPV6分離培養(yǎng)較為困難，目前仍未有成功分離該病毒的報道，因此后期需要深入對其最適宜培養(yǎng)細胞及培養(yǎng)條件進行研究，未來可嘗試通過構(gòu)建感染性克隆的方式拯救病毒。另外，對于PPV6的致病性研究不能局限于其單獨感染，還需探究其與PCV2、PCV3、PPV1、PRRSV、CSFV等其他病原的協(xié)同致病性。PPV6 Cap蛋白分子量較大，通過原核表達系統(tǒng)對其表達較為困難，后續(xù)的研究可嘗試通過真核表達系統(tǒng)表達PPV6 Cap蛋白，可為后續(xù)PPV6致病性及疫苗研究提供參考依據(jù)。