納米金剛石的分散、修飾及載藥應(yīng)用研究?

秦世榮 趙琪? 程振國(guó) 蘇麗霞 單崇新?

1)(鄭州大學(xué)物理工程學(xué)院,材料物理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450000)

2)(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,分子腫瘤學(xué)研究中心,鄭州 450052)

1 引 言

近年來(lái),隨著納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展,納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究受到了越來(lái)越多的關(guān)注[1?4].如半導(dǎo)體量子點(diǎn)、碳量子點(diǎn)、稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子等具有良好的熒光特性,可用作熒光探針對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,以實(shí)現(xiàn)腫瘤的定位和癌細(xì)胞擴(kuò)散的追蹤[5?7].此外,納米粒子獨(dú)特的尺寸和表面結(jié)構(gòu)特性使其可以負(fù)載藥物并將藥物輸運(yùn)至癌癥部位,實(shí)現(xiàn)靶向治療[8,9].因此,納米材料在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景.傳統(tǒng)的納米藥物載體包括碳納米管、脂質(zhì)體、聚合物納米粒子、金屬納米粒子等,可以通過(guò)化學(xué)連接,物理包覆等方式進(jìn)行藥物裝載[10?14],取得了良好的藥物治療效果.然而,由于這些材料具有化學(xué)性質(zhì)不夠穩(wěn)定、制備過(guò)程較為復(fù)雜、成本較高等缺點(diǎn),從而限制了其大規(guī)模的應(yīng)用.納米金剛石(nanodiamond,ND)是一種新穎的碳納米材料,化學(xué)穩(wěn)定性良好、生物毒性極低且具有良好的生物相容性,是目前已知毒性最低的納米材料[15?17],因此受到了越來(lái)越多的關(guān)注.此外,ND可通過(guò)成熟的爆轟法合成,方法簡(jiǎn)單,且可大批量生產(chǎn).爆轟法合成的納米金剛石的尺寸可小至3—5 nm,擁有較大的比表面積和豐富的表面官能團(tuán),通過(guò)對(duì)納米金剛石進(jìn)行特定的表面修飾可以實(shí)現(xiàn)表面功能化,功能化的ND可以通過(guò)物理吸附或化學(xué)嫁接的方式裝載小分子物質(zhì)或核酸,用于藥物運(yùn)輸或組織支架等[18?22],這使爆轟法ND展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景.然而,爆轟法納米金剛石尺寸較小,表面官能團(tuán)復(fù)雜,顆粒間可通過(guò)的范德瓦爾斯力、氫鍵等相互吸引,形成團(tuán)聚體,導(dǎo)致其在溶液中的分散性較差,從而限制了其在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[23?25].雖然有研究人員對(duì)納米金剛石的分散進(jìn)行了一些探究[26],然而對(duì)分散后的ND的藥物裝載和釋放性能以及生物毒性的探究還未見(jiàn)報(bào)道.

基于以上考慮,本文選取爆轟法納米金剛石作為碳納米材料,通過(guò)機(jī)械研磨和超聲分散的方法對(duì)其進(jìn)行了分散,然后通過(guò)酸洗使納米金剛石表面具有均一的化學(xué)官能團(tuán),改善了ND在溶液中的分散性;探究了表面功能化的ND對(duì)阿霉素的吸附和釋放特性以及功能化ND和載藥ND對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞系的生物毒性(圖1).整體上,本文對(duì)納米金剛石作為藥物運(yùn)輸載體的性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,這對(duì)于促進(jìn)其在藥物運(yùn)輸領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要的借鑒意義.

圖1 納米金剛石的分散、修飾及藥物裝載與釋放機(jī)理Fig.1.The disintegration,functionalization,drug loading and release of nanodiamond.

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

主要化學(xué)藥品包括:鹽酸阿霉素(上海阿拉丁生化科技有限公司)、納米金剛石粉末(鄭州華晶微鉆股份有限公司),濃鹽酸(A.R.)、濃硫酸(A.R.)、濃硝酸(A.R.)(洛陽(yáng)化學(xué)試劑廠)、氫氧化鈉(A.R.)(上海阿拉丁生化科技有限公司).

主要儀器:傅里葉變換紅外譜儀 (FTR,Thermol Nicolet iz10,美國(guó)),Zetasizer Nano ZS90(Malvern,英國(guó))、透射電子顯微鏡 (TEM,FEOL-2010,日本),X射線粉末衍射儀 (XRD,D/MAX-3B,日本)、分光光度計(jì) (UH-4150,Hitachi日本)、酶標(biāo)儀(Thermo Fisher,美國(guó)).

2.2 納米金剛石的分散

本文采用氯化鈉機(jī)械研磨和超聲破碎法對(duì)ND進(jìn)行分散.具體步驟為:首先將10 g氯化鈉晶體與0.25 g ND粉末置于瑪瑙研缽中混合并研磨30 min,隨后將混合物溶于20 mL去離子水中并轉(zhuǎn)移至50 mL燒杯中.使用超聲波發(fā)生器在60%輸出功率下對(duì)燒杯中的液體超聲破碎100 min(頻率60 kHz).超聲結(jié)束后,將溶液配置成100 mL去離子水溶液,分別裝入兩個(gè)50 mL eppendorf離心管中,以8000 r/min離心10 min,得到納米金剛石沉淀.然后將沉淀物重新分散于100 mL去離子水中并再次離心處理,在12000 r/min轉(zhuǎn)速下離心1 h.最后,倒掉上清液并將沉淀置于真空干燥箱中干燥48 h得到分散的納米金剛石.

2.3 納米金剛石的表面修飾

首先,將0.25 g的爆轟法納米金剛石置于馬弗爐中,在425?C下退火4 h.隨后,將退火的納米金剛石粉末分散于68 mL強(qiáng)氧化性的混合酸液中(H2SO4:HNO3=3:1)并在200 W的功率下超聲分散1 h,然后將其轉(zhuǎn)移到100 mL圓底燒瓶中于80?C恒溫?cái)嚢?8 h.攪拌結(jié)束后,待混合液冷卻至室溫,以8000 r/min離心5 min得到ND沉淀,先用RO水洗滌兩次后,再分別用0.1 M NaOH和HCl溶液對(duì)納米金剛石沉淀在100?C下各攪拌洗滌2 h,將沉淀離心干燥得到羧基化的納米金剛石粉末ND-COOH.

2.4 鹽酸阿霉素吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

根據(jù)Lambert-Beer定律,物質(zhì)對(duì)某一波長(zhǎng)的吸收度與物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系.因此,利用Lambert-Beer定律,在一定濃度范圍內(nèi)可以根據(jù)溶液中阿霉素的吸收度計(jì)算得到溶液中阿霉素的濃度.而這需要首先得到濃度與吸收度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.為了繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將鹽酸阿霉素配置成0.2,0.1,0.05,0.025,0.0125 mg/mL等一系列不同濃度的水溶液,然后使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)量不同濃度阿霉素溶液的吸收譜,從而得到500 nm處的吸光度值隨濃度的變化關(guān)系,通過(guò)origin線性擬合,得到阿霉素的吸收度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.5 納米金剛石的藥物負(fù)載與藥物釋放性能測(cè)試

將10 mg羧基化的納米金剛石分散于50 mL去離子水中超聲振蕩10 min使納米金剛石得到充分分散,隨后向溶液中加入5 mg鹽酸阿霉素并持續(xù)攪拌.隨后,以特定的時(shí)間間隔取2 mL溶液進(jìn)行離心得到上清液,并使用分光光度計(jì)測(cè)上清液中阿霉素的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到阿霉素的含量.然后將不同時(shí)間點(diǎn)阿霉素含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合,得到阿霉素的裝載量隨時(shí)間變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線.負(fù)載藥物后得到的ND-藥物復(fù)合體記為ND-dox.

在藥物釋放實(shí)驗(yàn)中,將5 mg ND-dox藥物復(fù)合體溶于12 mL去離子水中分散均勻,然后分別裝入三個(gè)透析袋中.將透析袋放入100 mL pH 5.0,6.5,7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,在37?C恒溫?cái)嚢?300 r/min).在特定的時(shí)間點(diǎn)取PBS溶液進(jìn)行吸光度測(cè)量,持續(xù)20 h.最后,根據(jù)吸收度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算阿霉素的釋放量,進(jìn)而得到阿霉素的累積釋放量隨時(shí)間的變化曲線.

2.6 細(xì)胞毒性和細(xì)胞殺傷性能檢測(cè)

將SGC-7901胃癌細(xì)胞系培植于96孔板中,每孔密度為8000,然后在37?C,5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h.隨后,用新鮮的DMEM培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞,向每孔加入100μL新鮮的DMEM培養(yǎng)液并加入不同濃度的羧基化納米金剛石ND-COOH以及ND-dox,在37?C,5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h.最后,向細(xì)胞板的每個(gè)孔中加入10μL MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,培養(yǎng)2 h.最后,使用酶標(biāo)儀測(cè)量每孔細(xì)胞在490 nm處的吸光度,計(jì)算出每孔細(xì)胞的活性.

3 結(jié)果與討論

3.1 ND的形貌和結(jié)構(gòu)

如圖2(a)所示,從TEM圖中可以看到ND由于顆粒之間的范德瓦耳斯力和氫鍵等相互作用而形成了團(tuán)聚體.雖然爆ND單晶粒的尺寸為5 nm左右(圖2(a)插圖),然而其團(tuán)聚體的尺寸則達(dá)到了幾百納米,這不利于其進(jìn)一步的應(yīng)用.從圖2(b)中高分辨率透射電鏡圖可以看到明顯的衍射條紋,條紋間距為0.206 nm,與金剛石(111)面的晶格衍射相符合[19].圖2(c)所示為ND粉末的XRD譜,在2θ =43.57?和2θ =75.15?處出現(xiàn)了明顯的衍射峰.與金剛石標(biāo)準(zhǔn)pdf卡片對(duì)比,ND的衍射峰與pdf卡片中金剛石的衍射峰符合得較好,表明43.57?和75.15?的衍射峰分別來(lái)自納米金剛石(111)面和(022)面的晶格衍射.以上結(jié)果表明,雖然爆轟法ND單晶的粒徑為3—5 nm,但是其形成了較大尺寸的團(tuán)聚體(<200 nm),因此對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分散是必要的.

圖2 (a)ND的透射電鏡圖;(b)ND的高分辨率透射電鏡圖;(c)ND的X射線衍射譜圖Fig.2.(a)TEM;(b)HRTEM;(c)XRD spectrum of ND.

圖3 納米金剛石的粒徑分布和膠體 (a)研磨分散前的粒徑分布;(b)研磨分散后的粒徑分布;(c)0 h時(shí)納米金剛石膠體照片;(d)12 h時(shí)納米金剛石膠體圖片F(xiàn)ig.3.Size distribution and colloidal of nanodiamond:(a)Before deaggregation and(b)after deaggregation;(c)the colloidal of nanodiamond at 0 h;(d)the colloidal of nanodiamond at 12 h.

圖4(a)ND的FTIR譜;(b)溶液中ND與ND-COOH的zeta電勢(shì)Fig.4.(a)FTIR spectra of nanodiamond;(b)zeta potential of ND and ND-COOH in solution.

ND顆粒之間由于相互吸引作用形成的大尺寸團(tuán)聚體使其在水溶液中的分散性較差.為了提高ND在水溶液中分散性,我們采用NaCl機(jī)械研磨與超聲破碎相結(jié)合的方法對(duì)其團(tuán)聚體進(jìn)行解離.將10 g NaCl晶體與0.25 g ND混合后,ND團(tuán)聚體被均勻地分散在NaCl中,在機(jī)械研磨的外力作用下,ND團(tuán)聚體受到周圍NaCl晶體持續(xù)的碰撞和碾壓,在碰撞和碾壓過(guò)程中提供的能量足以破壞ND顆粒之間的范德瓦耳斯、氫鍵等相互作用能,從而對(duì)ND團(tuán)聚體進(jìn)行解離.最后再使用超聲破碎儀對(duì)解離后的ND進(jìn)行進(jìn)一步的破碎,并用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)量納米金剛石分散前后的粒徑分布.結(jié)果如圖3所示,分散之前ND的粒徑集中分布在230,1483以及4800nm處,平均粒徑為1525 nm(圖3(a)).而研磨超聲分散之后,ND的粒徑集中分布在91 nm附近,平均粒徑為215 nm,與分散之前相比減小了6倍(圖3(b)).圖3(c)和圖3(d)分別展示了ND分散前后其膠體溶液分散狀態(tài)隨靜置時(shí)間的變化.分散之前的ND膠體(標(biāo)記為H)在0 h呈均勻的膠體分散狀態(tài)(圖3(c)),而12 h之后溶液上半部分逐漸變澄清,這是因?yàn)榇箢w粒的ND團(tuán)聚體迅速沉降在了樣品池底部(圖3(d)).相比之下,經(jīng)過(guò)機(jī)械分散后的ND由于具有更小的粒徑,其膠體(標(biāo)記為J)在12 h內(nèi)的狀態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯變化,表現(xiàn)出良好的膠體穩(wěn)定性.這說(shuō)明通過(guò)研磨和超聲破碎對(duì)ND進(jìn)行分散,有效減小了納米金剛石團(tuán)聚體的粒徑,從而明顯提升了ND膠體的穩(wěn)定性,改善了ND的分散效果.

ND表面具有豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)如sp2碳,C—H,C—O等,為了使ND可以應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,對(duì)其表面進(jìn)行功能化得到均一的表面官能團(tuán)具有重要意義.本文通過(guò)混合酸氧化的方法在ND表面修飾了均一的羧基官能團(tuán)(—COOH),得到了羧基修飾的納米金剛石(ND-COOH).ND-COOH在水溶液中電離出H+從而具有負(fù)的表面電勢(shì),可以吸引帶正電的小分子[19].如圖4(a)紅外譜所示,與未經(jīng)修飾的ND相比,酸洗處理后的納米金剛石FTIR譜中2930 cm?1附近C—Hx的伸縮振動(dòng)峰消失,同時(shí)在1758 cm?1出現(xiàn)了明顯的C=O吸收峰,這來(lái)自—COOH中C=O伸縮振動(dòng),表明酸洗后ND表面C—Hx等化學(xué)結(jié)構(gòu)被氧化并生成了—COOH.圖4(b)界面電勢(shì)結(jié)果顯示,酸洗后的ND-COOH具有負(fù)的表面zeta電位,這是因?yàn)镹DCOOH表面羧基—COOH水解出H+后,轉(zhuǎn)變成帶負(fù)電的—COO?使ND-COOH表面呈現(xiàn)出負(fù)電性.未修飾的ND表面官能團(tuán)種類較為繁雜不均一,因此未修飾的ND顯示出微弱的正電性.因此,通過(guò)對(duì)ND進(jìn)行表面功能化修飾,得到了表面官能團(tuán)均一的羧基化納米金剛石ND-COOH,其表面的羧基官能團(tuán)在水溶液中呈現(xiàn)出負(fù)電性.

3.2 藥物的負(fù)載與釋放性能

本文采用鹽酸阿霉素(dox)作為模型藥物來(lái)探究納米金剛石的藥物負(fù)載與釋放性能,并采用吸光光度法對(duì)阿霉素的裝載和釋放進(jìn)行定量探究.根據(jù)Lambert-Beer定律,溶質(zhì)的吸光度與濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系:

(1)式中A為吸光度;T為透射比,是出射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值;K為摩爾吸收系數(shù),與物質(zhì)的性質(zhì)及入射光波長(zhǎng)有關(guān);c為物質(zhì)的濃度(mol/L);b為吸收層厚度(cm).

在吸光度檢測(cè)中,定義樣品池厚度b0,則樣品吸收層厚度也為b0,當(dāng)選定入射光波長(zhǎng)為500 nm后,阿霉素的摩爾吸收系數(shù)K0也為常數(shù),此時(shí)吸光度A0與阿霉素濃度c0呈線性關(guān)系,因此有

由于實(shí)驗(yàn)條件等外界因素會(huì)對(duì)儀器測(cè)量結(jié)果造成誤差,從而使A0與c0之間不成嚴(yán)格的正比關(guān)系,所以實(shí)際上

式中K0b0和h均為常數(shù).

在本實(shí)驗(yàn)中,如圖5(a)所示,阿霉素的吸光度隨濃度的減小而不斷下降.取阿霉素吸收譜中500 nm處的吸光度A0與濃度c0的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行擬合得到:

與(3)式比較得到

(5)式表明阿霉素的吸光度與濃度呈線性關(guān)系,符合Lambert-Beer定律(圖5(b)).利用(5)式,可以根據(jù)吸光度計(jì)算溶液中阿霉素的含量.

為了探究ND-COOH對(duì)藥物的負(fù)載能力并得到藥物復(fù)合體,將ND-COOH與鹽酸阿霉素混合溶于水中攪拌進(jìn)行藥物裝載.在藥物負(fù)載過(guò)程中,ND-COOH在水溶液中電離出H+后轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)電性的ND-COO?(如圖4(b)),這使其能夠吸附帶正電的小分子物質(zhì).鹽酸阿霉素分子鏈端的氨基在水溶液中質(zhì)子化后轉(zhuǎn)變?yōu)閹д姷腘H+3使阿霉素分子帶正電,因此鹽酸阿霉素可以通過(guò)靜電相互作用吸附在ND-COOH表面.如圖6(a)所示,ND對(duì)阿霉素的累積吸附量隨時(shí)間而緩慢增加,在24 h左右趨于穩(wěn)定,此時(shí)阿霉素在納米金剛石表面的吸附與脫附過(guò)程達(dá)到平衡,平衡時(shí)藥物吸附量為325μg/mg(Dox:ND),遠(yuǎn)高于目前已報(bào)道的ND的藥物裝載量[27].這是因?yàn)榧{米金剛石團(tuán)聚體被分散后增大了總體的表面積,提高了表面的吸附位點(diǎn),從而增加了對(duì)阿霉素的吸附量[28].所得到的負(fù)載藥物后的納米金剛石即為藥物復(fù)合體ND-dox.

圖5 阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線 (a)不同濃度阿霉素溶液的吸收譜;(b)吸收度與濃度關(guān)系的擬合曲線Fig.5.Standard curve of dox:(a)Absorbance of dox aqueous solution with different concentration;(b) fitting curve of absorbance versus concentration of dox.

圖6 (a)ND-COOH對(duì)阿霉素的吸附量隨時(shí)間的變化;(b)阿霉素與納米金剛石藥物復(fù)合體(ND-dox)的FTIR譜Fig.6.(a)The variation of loading quantity of dox versus time;(b)FTIR spectra of ND-dox compound.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證藥物復(fù)合體ND-dox的化學(xué)成分,采用FTIR分別對(duì)dox和ND-dox進(jìn)行了檢測(cè).結(jié)果如圖6(b)所示,在鹽酸阿霉素的FTIR譜中出現(xiàn)了特定化學(xué)結(jié)構(gòu)的特征峰,其中1727 cm?1處的吸收峰來(lái)自N—H彎曲振動(dòng),而1576,1005 cm?1處的吸收峰分別來(lái)自—CHx和C—OH鍵的彎曲振動(dòng)[29],這些峰位與阿霉素的分子結(jié)構(gòu)特征峰相符.在ND-dox的FTIR譜中,在1766 cm?1處出現(xiàn)了羧基的C=O伸縮振動(dòng),這來(lái)自于ND表面的羧基官能團(tuán),此外在1727,1576以及1005 cm?1附近也同時(shí)出現(xiàn)了阿霉素分子的特征吸收峰,進(jìn)一步說(shuō)明了藥物復(fù)合體中ND與阿霉素同時(shí)存在.

圖7 (a)在pH 5.0,6.5以及7.4的PBS中阿霉素的累積釋放量隨時(shí)間的變化;(b)阿霉素的脫吸附與環(huán)境pH的關(guān)系示意圖Fig.7.(a)The variation of cumulative release of dox in pH 5.0,6.5 and 7.4 PBS solutions;(b)schematic illustration of the desorption/adsorption process of dox.

納米粒子裝載抗腫瘤藥物在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷不同pH的生理環(huán)境.一般情況下,腫瘤組織部位pH為5.5左右呈酸性,明顯低于正常血液的pH 7.4,因此可以利用不同pH的PBS溶液模擬人體內(nèi)不同pH的生理環(huán)境.將裝有等量ND-dox藥物復(fù)合體的透析袋分別置于pH 5.0,6.5和7.4的PBS溶液中攪拌,并定時(shí)檢測(cè)溶液中阿霉素吸光度變化,然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線將溶液吸光度的變化轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚顾貪舛鹊淖兓?得到鹽酸阿霉素的累積釋放量.如圖7(a)所示,整體上,ND-dox在不同pH環(huán)境中的累積釋放量均隨時(shí)間的增加而緩慢增加,并在18 h之后趨于平穩(wěn),此時(shí)阿霉素的脫附與吸附達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡.其中,在pH 5.0的PBS中阿霉素的累積釋放達(dá)到85%,而在pH 6.5和7.4的PBS中,阿霉素的累積釋放則分別為58%和37%,表明溶液酸性越強(qiáng)越有利于阿霉素的釋放,從而表現(xiàn)出pH依賴藥物釋放特性.前面提到,ND-dox中,ND-COOH與dox之間通過(guò)羧酸根和氨基的靜電相互作用結(jié)合在一起(圖6),因此ND-dox的pH響應(yīng)依賴釋放行為來(lái)自于納米金剛石羧基與阿霉素分子之間的靜電相互作用強(qiáng)度隨環(huán)境pH值的變化.如圖7(b)所示,在低pH溶液中,H+濃度較高,此時(shí)ND-COOH表面的—COO?被還原為—COOH,減弱了ND-COOH與阿霉素分子之間的靜電相互作用,從而促進(jìn)了阿霉素的釋放,且H+濃度越高,ND-COOH表面的—COO?越少,平衡狀態(tài)下阿霉素的釋放量越大,從而呈現(xiàn)出pH依賴藥物施放特性.一般情況下,人體腫瘤組織的pH為5.5左右,比正常組織的pH低[30,31],因此利用ND-COOH對(duì)阿霉素的pH響應(yīng)釋放特性,可用ND-COOH作為納米載體實(shí)現(xiàn)藥物輸運(yùn)和pH觸發(fā)靶向釋放,這將有助于提高藥物的利用率并降低藥物對(duì)正常組織的毒副作用.

3.3 細(xì)胞毒性

納米粒子的生物毒性及其載藥治療效果是納米粒子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的重要指標(biāo),因此本文采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢驗(yàn)了ND的生物毒性及其藥物復(fù)合體ND-dox對(duì)細(xì)胞的殺傷力.MTT檢測(cè)結(jié)果如圖8所示,在0—150μg/mL濃度范圍內(nèi),雖然SGC-7901細(xì)胞活性隨濃度增加有所下降,但整體上均大于85%,說(shuō)明ND-COOH具有較低的生物毒性.而藥物復(fù)合體ND-dox對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如圖8)表明,在0—80μg/mL濃度范圍內(nèi),SGC-7901細(xì)胞的活性沒(méi)有明顯變化,而當(dāng)濃度大于80μg/mL時(shí),ND-dox對(duì)SGC-7901細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的抑制作用,這是因?yàn)殡S著DMEM中ND-dox含量的增加,dox的累積釋放量也不斷上升,從而增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷.因此,綜合以上結(jié)果,經(jīng)過(guò)分散和表面功能化的ND對(duì)SGC-7901細(xì)胞的活性沒(méi)有顯著影響,具有較低的生物毒性,而其負(fù)載藥物后可實(shí)現(xiàn)藥物的體外釋放和細(xì)胞有效殺傷.

圖8 ND與ND-dox對(duì)SGC-7901細(xì)胞活性的影響(n=3,p<0.05)Fig.8.In fluence of ND and ND-dox on the viability of SGC-7901(n=3,p<0.05).

4 結(jié) 論

本文對(duì)ND的分散、功能化修飾、藥物裝載與釋放特性以及細(xì)胞毒性進(jìn)行了系統(tǒng)的探究和討論.通過(guò)氯化鈉研磨和超聲破碎法對(duì)爆轟法納米金剛石進(jìn)行解離,使其團(tuán)聚體粒徑減小了6倍.通過(guò)強(qiáng)酸氧化處理得到了表面羧基化的納米金剛石NDCOOH,其在水溶液中由于羧基電離后呈現(xiàn)出較高的負(fù)Zeta電位?30.6 mV,這使其可以與阿霉素分子之間通過(guò)靜電相互作用相結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)阿霉素的負(fù)載得到ND-dox.由于納米金剛石的有效分散提高了納米金剛石表面吸附位點(diǎn)數(shù)量,因此納米金剛石對(duì)鹽酸阿霉素的裝載率達(dá)到了325μg/mL.此外,由于高濃度H+會(huì)導(dǎo)致ND-COOH與dox分子之間靜電相互作用減弱,因此ND-dox藥物復(fù)合體在低pH的PBS溶液中具有較高的藥物釋放速率,表現(xiàn)出顯著的pH依賴藥物釋放特性,這個(gè)特點(diǎn)使其有望用于pH觸發(fā)靶向藥物輸運(yùn).最后,ND-COOH的細(xì)胞毒性和ND-dox對(duì)SGC-7901細(xì)胞系的殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明,羧基功能化后的ND具有較低的細(xì)胞毒性,而載藥后的ND-dox則可以對(duì)SGC-7901細(xì)胞系產(chǎn)生顯著的治療效果,表明ND作為藥物載體可以裝載藥物后進(jìn)行有效的腫瘤細(xì)胞殺傷.這些結(jié)果表明了納米金剛石在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有一定的發(fā)展?jié)摿?此外,本工作為納米金剛石在藥物運(yùn)輸載體方面的應(yīng)用提供了借鑒.

感謝鄭州大學(xué)物理工程學(xué)院“金剛石光電材料與器件”課題組所有老師和同學(xué)在材料表征、理論分析等方面提供的幫助;感謝鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院王堯河老師和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院樊慧杰老師在生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)上提供的支持.