木犀草素對急性酒精性肝損傷的保護作用*

權 彥，李小蓉，趙忠孝，劉靖麗，張 朋

陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046

急性酒精性肝損傷，即酒醉，是指因過度飲酒而引起的急性神經和軀體障礙［1］，肝臟作為主要的解毒器官，過量飲酒將導致肝臟形態(tài)改變和功能紊亂［2］。此外，酒精對中樞神經系統(tǒng)具有一定的抑制作用，而中樞神經系統(tǒng)含有大量脂肪且過氧化氫酶活性較低，超氧化物歧化酶含量較低，這又容易引起自由基的過量產生從而損害機體健康［3-4］。木犀草素(3′，4′，5，7- 四羥基黃酮)是一種天然四羥基黃酮化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、中草藥等天然植物中，如芹菜、西蘭花、菊花、胡蘿卜、胡椒、卷心菜、蘋果皮和洋蔥的葉子等［5-8］。木犀草素具有多種藥理活性［9］，隨著對木犀草素研究的深入，發(fā)現它具抗炎、抗氧化以及對神經系統(tǒng)的保護作用［6，8，10-11］。因此，富含木犀草素的植物常常被用作中藥治療疾病。研究表明黃酮類化合物木犀草素，具有抗氧化性從而改善氧化應激引起的肝損傷和神經性損傷［12-14］。本文旨在討論木犀草素(luteolin)對酒精所致小鼠急性肝損傷的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 木犀草素(南京普怡生物科技有限公司，批號：150811)；56%(V/V)紅星二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司，批號：150703)；實驗時，用蒸餾水配成所需濃度的混懸液；丙氨酸氨基轉移酶(批號：20150423)、天冬氨酸氨基轉移酶(批號：20150226)、甘油三酯(批號：20160112)和膽固醇(批號：20161102)、測定試劑盒及脂質過氧化物(批號：20161023)、超氧化物歧化酶(批號：20160304)測試盒均購自南京建成生物工程研究所；蘇木精(批號：20160304)、伊紅染料(批號：20160506)均購自上海生趁化工公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 防醉實驗 6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠60只［西安交通大學醫(yī)學部動物中心，動物合格證號：SYXK(陜)2015-013］，自由進食飲水，自然晝夜采光，室溫22～24℃，每日早晚喂食、換水。適應性喂養(yǎng)1周，隨機分成5組，空白對照組、模型對照組、木犀草素低劑量組(25 mg/kg)、木犀草素中劑量組(50mg/kg)、木犀草素高劑量組(100mg/kg)，每組12只。正常對照組和模型組給予同體積蒸餾水(灌胃)。每日稱重，根據體質量調整用藥量。連續(xù)灌胃(10天)。末次給藥后，禁食16小時，模型組和各劑量組一次性予56%紅星二鍋頭(0.016 mL/g)灌胃，進行翻正反射實驗。實驗期間，各組小鼠予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，組間各因素無差異。將小鼠背向下輕輕放在鼠籠里，如果保持仰位姿勢30秒以上，則認為小鼠翻正反射消失，記錄小鼠給酒后到翻正反射消失時間以及小鼠翻正反射消失至恢復正常所需要的時間［16］。

1.2.2 急性酒精性肝損傷實驗 6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠60只，自由進食飲水，自然晝夜采光，室溫22～24℃，每日早晚喂食、換水。適應性喂養(yǎng)1周，隨機分成5組，空白對照組、模型對照組、陽性對照組(聯苯雙酯150 mg/(kg·d)、木犀草素低劑量組(25mg/kg)、木犀草素中劑量組(50mg/kg)、木犀草素高劑量組(100 mg/kg)，每組10只。每天給對應劑量木犀草素或聯苯雙酯1次，正常對照組和模型對照組給予等量蒸餾水；給藥30分鐘后，模型對照組和各給藥組用56%(V/V)紅星二鍋頭白酒灌胃，0.01 mL/g，每天1次，每天增加0.001 mL/g，直至增加到0.015 mL/g，保持至試驗結束。連續(xù)灌胃10天，觀察小鼠實驗期間生理狀態(tài)，并于實驗始末分別記錄各組小鼠體質量并計算臟器系數。

1.3 檢測指標 末次灌胃后，禁食不禁水過夜，24小時后處死小鼠，摘眼球取血，分離血清。另于肝臟右葉取小塊肝組織，4%多聚甲醛固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(厚度為4μm)備用，再用蘇木素-伊紅(HE)染色，通過倒置熒光顯微鏡在200×放大倍數下觀察模型組和給藥組的病理學形態(tài)。采血后取肝右葉約0.5 g，在低溫條件下剪碎，放入勻漿器中，再加入9倍體積的冷生理鹽水，研磨成勻漿后，離心取得肝勻漿液。按照試劑盒說明檢測血清中AST、ALT、TG、TC含量，勻漿中MDA和SOD含量。

1.4 統(tǒng)計學方法 試驗數據采用Excel進行整理，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以(±s)表示，采用 t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 木犀草素醒酒實驗結果 在醒酒實驗中，模型對照組和木犀草素各劑量給藥組均出現酒后步態(tài)不穩(wěn)等運動失調現象。小鼠翻正反射消失時間、小鼠翻正反射恢復時間，模型對照組與木犀草素各劑量組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 木犀草素對小鼠急性酒精性肝損傷實驗結果

2.2.1 小鼠一般生理狀態(tài) 空白對照組小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛光滑色澤鮮亮，活動及飲食正常，體質量明顯增加；模型對照組小鼠精神萎靡不振，毛色粗糙、無光澤、發(fā)黃，飲食和活動明顯減少且體質量增加緩慢，大便溏膩。木犀草素低、中、高劑量組及聯苯雙酯陽性對照組的小鼠精神活動良好，皮毛光滑有色澤，體質量雖有增加，但較正常組的小鼠體質量增加慢，狀態(tài)好于模型組。

2.2.2 木犀草素對小鼠體質量、肝指數及血清AST和ALT的影響 小鼠體質量，模型對照組低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；木犀草素各劑量組高于模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。肝指數，模型對照組高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，木犀草素各劑量組低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。小鼠血清ALT、AST水平，模型對照組高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；木犀草素高、中、低劑量組均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.2.3 木犀草素對急性酒精性肝損傷小鼠血清TC、TG水平及勻漿中SOD、MDA含量的影響 與模型對照組比較，木犀草素各劑量組均可以有效降低小鼠急性酒精性肝損傷中血清TC和TG水平和肝勻漿中MDA含量，同時增加SOD活性，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.2.4 木犀草素對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟病理變化分析 空白對照組、陽性藥和木犀草素高劑量組肝臟均無明顯的病理變化，肝細胞基本完整，肝小葉清晰，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀整齊排列(圖1A)，模型組肝臟細胞間隙有輕度淤血，肝細胞排列紊亂，可見炎性細胞浸潤，且有細小脂滴堆積(圖1B)陽性藥細胞結構接近完整(圖1C)木犀草素高、中、低劑量組肝細胞脂肪變性程度依次減輕，炎細胞浸潤和點狀壞死明顯減少。圖1D，1E，1F結果表明，木犀草素高、中、低劑量組可不同程度抑制肝臟脂肪變性，緩解肝損傷。見圖1。

表1 木犀草素對醉酒小鼠翻正反射的影響(±s)

表1 木犀草素對醉酒小鼠翻正反射的影響(±s)

注：＊表示與模型對照組相比，P＜0.05

組別 只數 劑量/(mg·kg-1) 翻正反射消失時間/min 翻正反射恢復時間/min模型對照組 12 - 19.3±1.2 323.5±15.7木犀草素高劑量組 12 100 32.2±1.8＊ 238.3±27.3＊木犀草素中劑量組 12 50 28.3±2.7＊ 264.2±23.5＊木犀草素低劑量組 12 25 20.4±2.5＊ 308.7±20.1＊

表2 木犀草素對急性酒精性肝損傷小鼠體質量和肝指數的影響(±s)

表2 木犀草素對急性酒精性肝損傷小鼠體質量和肝指數的影響(±s)

注：#表示與對照組比較，P＜0.05；與模型對照組比較，＊表示P＜0.05，＊＊表示P＜0.01

組別 只數 體質量/g 肝臟指數/% AST/(IU·L-1） ALT/(IU·L-1）空白對照組 10 35.3±1.7 6.2±0.3 137.5±5.9 32.4±4.3模型對照組 10 24.2±1.9# 7.3±0.7# 310.5±43.7# 223.5±15.7#聯苯雙酯組 10 29.7±1.3＊ 6.5±0.4＊ 213.3±23.8＊ 143.7±28.3＊木犀草素高劑量組 10 28.8±1.8＊ 6.1±0.9＊ 194.2±23.5＊ 154.6±20.1＊木犀草素中劑量組 10 27.3±2.1 6.3±0.8＊ 284.6±27.3＊ 185.5±11.9＊＊木犀草素低劑量組 10 25.4±1.5＊ 7.0±0.2＊＊ 304.5±21.7＊＊ 194.2±19.4＊＊

表3 木犀草素對急性酒精性肝損傷小鼠血清TC、TG和勻漿中SO D及M D A含量影響(±s)

表3 木犀草素對急性酒精性肝損傷小鼠血清TC、TG和勻漿中SO D及M D A含量影響(±s)

注：#表示與空白對照組相比P＜0.01，＊＊表示與模型組比較P＜0.01

分組 只數 TC/(nmol·L-1) TG/(mmol·L-1) MDA/(nmol·L-1) SOD/(U·mg-1)t值 p值 t值 p值 t值 p值 t值 p值對照組 10 / / / / / / / /模型組 10 -4.60 ＜0.01 -5.71 ＜0.01 -6.43 ＜0.01 12.40 ＜0.01聯苯雙酯組 10 -4.79 ＜0.01 -6.05 ＜0.01 -6.05 ＜0.01 11.90 ＜0.01木犀草素高劑量組 10 -4.55 ＜0.01 -7.38＜0.01 -6.40 ＜0.01 9.35 ＜0.01木犀草素中劑量組 10 -4.31 ＜0.01 -4.79 ＜0.01 -5.12 ＜0.01 7.75 ＜0.01木犀草素低劑量組 10 0.79 / -3.01 ＜0.01 -4.90 ＜0.01 6.00 ＜0.01

圖1 木犀草素對小鼠急性酒精性肝損傷的肝組織病理學影響（HE×200）

3 討論

在我國，酒精所致的肝損傷是繼病毒性肝炎外的第二大肝病。肝臟作為主要的解毒器官，在短期大量飲酒后，會造成肝損傷。酒精性肝病的臨床表現分為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化和酒精性肝細胞癌癥。應用中藥提取物治療酒精性肝損傷，既可以為民族醫(yī)學的發(fā)展帶來契機，又可以減少西藥的不良反應。本實驗通過建立醉酒模型考察木犀草素醒酒作用，與模型對照組比較，木犀草素各劑量組可以不同程度延長小鼠翻正反射消失時間，縮短翻正反射恢復時間從而改善小鼠的醉酒狀態(tài)。同時建立急性酒精性肝損傷模型，與模型對照組比較，木犀草素顯著降低血清中AST、ALT、TC和TG水平，增加勻漿中SOD含量，降低勻漿中MDA含量，說明木犀草素具有抗氧化活性。此外，通過HE染色考察病理組織學改變情況，發(fā)現木犀草素可以減輕肝細胞脂肪變性，減少炎性細胞浸潤和點狀壞死。近年來，關于木樨草素的研究已涉及多方面，其中木犀草素能明顯改善四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化［14］，還可以改善HO-1誘導的急性胰腺炎。關于木犀草素對酒精肝作用研究較少，而抗酒精性肝損傷的藥物缺乏有效性，研究表明木犀草素具有醒酒的作用且對酒精性肝損傷具有一定的保護作用，關于其抗酒精性肝損傷的進一步機制還有待研究。