不同產地貓爪草中粗多糖和多糖含量的比較研究

王海燕，梁利香

(信陽農林學院 生物與制藥工程學院，河南 信陽 464000)

貓爪草為毛茛科植物小毛茛Radix Ranunculi Ternati.的干燥塊根，收載于《中國藥典》2015年版(一部)。貓爪草原為無名野草，藥用歷史較短，是上世紀50年代于河南省信陽地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種草藥，后經(jīng)信陽中醫(yī)院依據(jù)其根形及能治療鼠瘡的特點定名為“貓爪草”。對其藥理歷代本草均無記載，民間主要用于治療頸淋巴結核(俗稱老鼠瘡)、腮腺炎(俗稱痄腮)。文字記載則首見于《中藥材手冊》，1977年《中華人民共和國藥典》開始收載，《中國藥用植物志》《廣西中藥志》《河南中草藥手冊》《湖北植物志》等也有記載。貓爪草主產于河南信陽地區(qū)的淮濱、息縣及駐馬店地區(qū)的正陽、確山；另外，我國長江中、下游 (包括浙江、江蘇、安徽、江西、廣西、河南、湖北、湖南、四川、云南、貴州等省) 以及臺灣地區(qū)均有分布， 在日本本州、四國、九州也有分布[1-2]。功能化痰散結，解毒消腫，用于瘰疬痰核，疔瘡腫毒，蛇蟲咬傷[3]。貓爪草是河南省的一大宗藥材，同時被列為國家藥品監(jiān)督管理局重點發(fā)展的63種緊缺中藥材之一，是國家重點發(fā)展的三類中藥材之一?，F(xiàn)在臨床用于治療淋巴結結核、淋巴結炎、肺結核、咽炎、淋巴瘤、甲狀腺瘤、乳腺腫瘤、肺癌等疾病[4-5]。貓爪草近年來由于其抗腫瘤活性備受人們的關注，諸多實驗研究表明貓爪草多糖(PRT)是其抗腫瘤、抗氧化、保肝、調節(jié)免疫的活性成分[6-11]。本實驗對不同產地貓爪草中粗多糖和多糖的含量進行對比研究，為河南產貓爪草的道地性、資源開發(fā)和質量控制提供實驗依據(jù)。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料與試劑

貓爪草分別產自河南信陽地區(qū)的淮濱和息縣、河南駐馬店地區(qū)的正陽和確山、湖北、江蘇、安徽、浙江、江西、廣西、湖南、四川、云南、貴州等地，由信陽農林學院中藥教研室鑒定為毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根，藥材來源見表1。無水葡萄糖標準品(中國計量科學研究院，批號為GBW1006213001,含量為99%)；酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、無水硫酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇等均為分析純，純化水自制。

1.2 儀器

751G型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)；水循環(huán)恒溫水浴箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；AB-135-S型電子天平(梅特勒-托利多儀器制造有限公司)；SCQ-8201E超聲清洗儀(上海聲彥超聲波儀器設備有限公司)。

表1 藥材來源

1.3 藥材處理

將貓爪草挑練、淘洗后，105℃烘干，粉碎成60目，備用。

2 實驗方法

2.1 DNS試劑配制

稱取酒石酸鉀鈉18.2g，溶于50ml蒸餾水中，加熱(50℃以下)，于熱溶液中依次加入2.1g氫氧化鈉、0.63g 3,5-二硝基水楊酸、苯酚0.5g和無水亞硫酸鈉0.5g，超聲(45～50℃)至溶，冷卻后用蒸餾水定容至100ml，棕色瓶儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標準曲線的制備

2.2.1 葡萄糖標準溶液的配制 精密稱定105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品59.1mg于50ml容量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得葡萄糖對照品溶液。

2.2.2 標準曲線的制備 精密移取上述葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、1.0 mL于6只25 mL容量瓶中，加水至1mL，加DNS試劑3mL，沸水浴加熱15min，迅速冷卻至室溫，加水稀釋至刻度。按照紫外-可見分光光度法[12]，在550nm處測定吸光度。以濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A=0.013385C-0.03355(r=0.9992)，結果表明葡萄糖在9.456～47.28μg/mL范圍內線性良好。結果見表2和圖1。

圖1葡萄糖標準曲線

表2 葡萄糖標準溶液吸收度測定結果

2.3 貓爪草中粗多糖和多糖的含量測定

2.3.1粗多糖的制備及收率測定 取各產地貓爪草藥材粉末(60目)各3份，每份100g，加藥材量0.2%的α-淀粉酶和3倍量水進行酶解，酶解溫度 50℃，酶解pH值為 6 ，酶解時間30min；再加7倍量水超聲提取20min，超聲功率為300W；抽濾，濾渣再加水超聲提取2次，每次加水10倍量，提取20min，合并3次α-淀粉酶協(xié)同超聲提取法提取所得水提液，濃縮至約100mL(每mL藥液相當于1g藥材)，冷卻至室溫，加乙醇至乙醇含量70%，置冰箱中冷藏過夜，抽濾，60℃干燥，即得。稱量、計算粗多糖收率，結果見表3。

2.3.2 多糖溶液的制備及測定 稱取貓爪草粗多糖約30mg，置25ml容量瓶中，加水5mL，加6mol/L鹽酸6mL，超聲溶解，置90℃烘箱中，加熱30min，取出冷卻至室溫，加6mol/L氫氧化鈉溶液至溶液呈中性，加水至刻度，過濾，取續(xù)濾液2 mL置25 mL容量瓶中，加DNS試劑3mL，沸水浴加熱15min，迅速冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，550nm處測定吸光度，計算粗多糖中多糖的含量，結果見表3。用Excel中單因素方差分析對14個產地和河南省4個產地貓爪草中粗多糖含量(%)和多糖含量(%)進行統(tǒng)計分析，并對不同產地粗多糖和多糖含量的相關性進行顯著性檢驗，結果見表4-8。

表3 不同產地貓爪草中粗多糖和多糖含量(n=3)

表4 14個產地粗多糖含量的顯著性差異方差分析表

表5 14個產地多糖含量的顯著性差異方差分析表

表6 4個產地粗多糖含量的顯著性差異方差分析表

表7 4個產地多糖含量的顯著性差異方差分析表

表8 粗多糖和多糖含量相關性檢驗

3 結論與討論

試驗結果表明，不同產地貓爪草中粗多糖和多糖的含量有極顯著差異。14個產地粗多糖含量(%)F值為135.3905(p《0.01)，多糖含量(%)F值為151.7603(p《0.01),以河南信陽淮濱產貓爪草中總糖和多糖的含量最高；但河南四個產地(1-4號)產的貓爪草中粗多糖和多糖的含量無明顯差異，粗多糖含量F值為3.628(p=0.06>0.05)，多糖含量F值為2.63(p=0.122>0.05)。即本試驗結果表明：在被考察產地中以河南信陽貓爪草中粗多糖和多糖含量最高，且與其它產地有顯著性差異，貓爪草中粗多糖和多糖含量具有顯著相關性。貓爪草的采收季節(jié)為春季和秋季，本試驗研究結果表明不同產地貓爪草中粗多糖和多糖的含量差異明顯，原因或許是地域差異也或許是季節(jié)差異所致或與地域、采收季節(jié)均有關系，有待進一步研究。

多糖的測定方法有多種，目前國內測定中藥材中多糖含量的方法以比色法為主，包括咔唑一硫酸、蒽酮一硫酸 、苯酚-硫酸、3 ，5-二硝基水楊酸、鄰甲苯胺法等。較常用的是苯酚-硫酸法和蒽酮一硫酸法，其原理均是己糖在硫酸作用下，分子內脫水生成糠醛可與之縮合成有色配合物，可在可見波長區(qū)有最大吸收。但因苯酚-硫酸法中所用苯酚試劑需蒸餾后方可使用，且污染較大；蒽酮-硫酸法，操作繁瑣，顯色時間、溫度、操作的快慢等都會對測定結果有不同程度的影響。本實驗采用水解后以DNS試劑顯色，實驗表明線性良好，顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，操作簡單，適用于貓爪草中多糖的比色測定。