重組禽流感病毒H7N9 H7-Re1株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

李莉，杜鑫，張麗娜，楊柳，高曉慶，唐東雪，趙海源，蔣曉梅，張?zhí)焓?，李金?/p>

（1吉林冠界生物技術(shù)有限公司，吉林梅河口 135000; 2新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院，烏魯木齊 830000；3新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊 830000；4中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京 100081）

0 引言

【研究意義】禽流感（avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起的以主要感染家禽、野禽、水禽的一種急性高度接觸性傳染病，國際衛(wèi)生組織將其列為必須上報(bào)的動(dòng)物疫病，我國將其列為一類疫病，禽流感不僅感染禽，也感染哺乳動(dòng)物和人[1]，根據(jù)禽流感病毒的致病性可分為高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（low pathogenic avian influenza，LPAI），在16個(gè)亞型中并不是每一個(gè)亞型的流感病毒均表現(xiàn)為對(duì)禽的高致病性[2]，歷史上每次HPAI的暴發(fā)均由H5或 H7亞型病毒引起，當(dāng)然并不是所有的H5或H7亞型流感病毒均為高致病力毒株，自從1959年HPAI首次報(bào)道以來，每次 HPAI的暴發(fā)都給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。近年來，我國暴發(fā)了多起嚴(yán)重的H5亞型和H7亞型高致病性禽流感疫情，各日齡及各品種禽群均可感染發(fā)病，家禽感染后死亡率非常高，接近100%[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】現(xiàn)階段疫苗接種仍是我國控制禽流感的主要措施之一[6]，目前市場上大部分疫苗仍用雞胚制備，需要大量的易感雞胚，且產(chǎn)量低，不同批次間病毒含量一致性差，雞胚殘?bào)w不宜處理，不利于應(yīng)對(duì)大規(guī)模的禽流感疫情暴發(fā)，在禽流感疫苗的需求不斷增加的情形下，曾一度造成禽流感疫苗供應(yīng)量不足的緊張局面[7-8]，且病毒在雞胚中連續(xù)傳代可引起HA基因發(fā)生突變、外源病毒污染等問題，因此，建立穩(wěn)定的有連續(xù)生產(chǎn)能力的病毒培養(yǎng)體系尤為重要。【本研究切入點(diǎn)】MDCK細(xì)胞被廣泛作為病毒的增殖基質(zhì)而應(yīng)用，可用于呼腸孤病毒、腺病毒、犬細(xì)小病毒及禽流感病毒等[9-12]。MDCK細(xì)胞與病毒親和性高、增殖速度快且不易發(fā)生突變，是培養(yǎng)禽流感病毒的敏感細(xì)胞之一[13]。利用連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)流感疫苗具有操作簡單、規(guī)模易放大，易于質(zhì)量控制，純度高，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)[14]，可彌補(bǔ)雞胚苗產(chǎn)量低，批間差異大等不足，完全可應(yīng)對(duì)禽流感大規(guī)模流行[15]。【擬解決的關(guān)鍵問題】在禽流感疫苗生產(chǎn)過程中, 所用抗原的病毒含量與疫苗的效力密切相關(guān)，所以本試驗(yàn)將重組禽流感病毒 H7N9 H7-Re1株在MDCK細(xì)胞上培養(yǎng)，并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出了最佳的培養(yǎng)體系，進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，并對(duì)不同代次毒種進(jìn)行病毒含量的比較, 篩選出了最穩(wěn)定、免疫原性最好的毒種，為生產(chǎn)高效價(jià)禽流感疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年6—12月，在吉林冠界生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 細(xì)胞和病毒

MDCK細(xì)胞（犬腎細(xì)胞）系購自ATCC公司（美國模式培養(yǎng)物集存庫）；懸浮MDCK細(xì)胞（犬腎細(xì)胞）為本公司自行馴化，重組禽流感病毒H7亞型H7-Re1株購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑及耗材

胎牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司，DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；MDCK無血清培養(yǎng)基選用培養(yǎng)基為國產(chǎn)無血清全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基；TPCK-胰酶購自 Sigma公司；PBS、PBS-EDTA、1%雞紅細(xì)胞懸液由本公司質(zhì)檢部自行制備；0.25%胰酶-EDTA購自Gibco公司；檢驗(yàn)用SPF雞胚購自北京梅里亞公司。

1.3 主要設(shè)備

倒置顯微鏡購自O(shè)lympus 公司，CO2培養(yǎng)箱購自 Themeo fisher公司，生物安全柜購自 Thermo fisher公司。

1.4 MDCK細(xì)胞培養(yǎng)H7N9 H7-Re1株方法

1.4.1 MDCK細(xì)胞培養(yǎng) 以（3—4）×104個(gè)／cm2密度接種MDCK細(xì)胞，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察，待長滿單層后用于病毒增殖。

1.4.2 病毒在MDCK細(xì)胞上增殖預(yù)試驗(yàn) 雞胚毒按病毒感染復(fù)數(shù)MOI為10-3接種MDCK細(xì)胞，MOI為感染病毒數(shù)/細(xì)胞數(shù)，接種3組，同時(shí)設(shè)1組不接毒的細(xì)胞作為空白對(duì)照。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔8 h取樣，測定各組各時(shí)間段病毒含量（HA效價(jià)、TCID50以及 EID50），將病毒含量最高的毒樣作為第一代種毒。

1.4.3 MDCK細(xì)胞上病毒培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.4.3.1 MDCK細(xì)胞上最佳接毒劑量（MOI或百分比）

取細(xì)胞毒按按 MOI為（10-5、10-4、10-3、10-2、10-1）或DMEM維持液量的（0.0008%、0.008%、0.08%、0.8%、8%）接種到MDCK細(xì)胞，每個(gè)劑量接種3組，同時(shí)設(shè)1組不接毒的細(xì)胞作為空白對(duì)照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，直至75%以上細(xì)胞病變，測定各組收毒時(shí)的病毒含量（HA效價(jià)、TCID50以及EID50）。

1.4.3.2 MDCK細(xì)胞上最佳收毒時(shí)間的確定 取細(xì)胞毒按MOI為10-4接種MDCK細(xì)胞，接種3組，同時(shí)設(shè)1組不接毒的細(xì)胞作為空白對(duì)照，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，從接毒后的24 h開始，每隔8 h取樣，直至收毒，測定其病毒含量（HA效價(jià)、TCID50以及EID50）。

1.4.3.3 MDCK細(xì)胞上最佳 TPCK-胰酶的確定 取細(xì)胞毒按MOI為10-4接種MDCK細(xì)胞，使TPCK-胰酶濃度分別為1、2、4、6、8 μg mL-1，每個(gè)TPCK-胰酶濃度接種3組，同時(shí)設(shè)1組不接毒的細(xì)胞作為空白對(duì)照，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，64 h收獲，測定各組病毒含量（HA效價(jià)、TCID50以及EID50）。

1.4.3.4 MDCK細(xì)胞上最佳接種方法的確定 取細(xì)胞毒按MOI為10-4接種MDCK細(xì)胞，分別采用吸附法

（作用1 h后，倒掉種毒稀釋液）與不吸附法，加入DMEM維持液（含TPCK-胰酶），各接種3組，同時(shí)設(shè)1組不接毒的細(xì)胞作為空白對(duì)照，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，64 h收獲測定各組病毒含量（HA效價(jià)、TCID50以及EID50）。

1.4.4 MDCK細(xì)胞上最佳病毒代次的確定 取雞胚毒按MOI為10-4接種MDCK細(xì)胞，胰酶終濃度為2 μg·mL-1置 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，培養(yǎng)時(shí)間為64 h按此方法，在MDCK細(xì)胞上連傳13代，每代各接種3組，同時(shí)設(shè)1組不接毒的細(xì)胞對(duì)照，測定各組病毒含量（HA效價(jià)、TCID50以及EID50）。

1.5 懸浮MDCK細(xì)胞培養(yǎng)H7N9 H7-Re1株

1.5.1 懸浮MDCK細(xì)胞培養(yǎng) 將懸浮MDCK細(xì)胞，以（1.0—2.0）×106cells/mL的起始密度，置 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，120—140 r/min進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)繁。待細(xì)胞密度達(dá)到（8.0—10.0）×106cells/mL左右時(shí)可用于接毒培養(yǎng)。補(bǔ)加病毒培養(yǎng)液使細(xì)胞懸液：病毒培養(yǎng)液=1.5∶1—1∶1。

1.5.2 懸浮MDCK細(xì)胞上增殖預(yù)試驗(yàn) 將雞胚毒按病毒感染復(fù)數(shù)MOI為 10-1、10-2、10-3接種懸浮 MDCK細(xì)胞，同時(shí)設(shè) 1組不接毒的細(xì)胞作為空白對(duì)照。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，120—140 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，從接毒后的24 h開始，每隔12 h取樣，直至75%以上細(xì)胞發(fā)生病變。測定各組病毒含量（HA效價(jià)、TCID50以及EID50），將病毒含量最高的毒樣作為第一代種毒。

1.5.3 懸浮MDCK細(xì)胞上最佳接毒劑量（MOI） 將上述懸浮細(xì)胞毒按 MOI為（10-4、10-3、10-2、10-1）接種懸浮MDCK細(xì)胞中，每個(gè)劑量接種3組，同時(shí)設(shè)1組不接毒的細(xì)胞作為空白對(duì)照，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，120—140 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，直至75%以上細(xì)胞病變，收毒取樣，測定各組病毒含量（HA效價(jià)、TCID50以及EID50）。

1.5.4 懸浮MDCK細(xì)胞上最佳收毒時(shí)間的確定 取懸浮種毒按MOI為10-2接種懸浮MDCK細(xì)胞，接種3組，每組接種3瓶，同時(shí)設(shè)1組不接毒的細(xì)胞對(duì)照，作為空白對(duì)照，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，從接毒后的24 h開始，每隔12 h取樣，將每組樣混勻后測其病毒含量（HA效價(jià)、TCID50以及 EID50）直至收毒，將每組樣混勻后測其病毒含量（HA效價(jià)、TCID50以及EID50）。

1.5.5 懸浮MDCK細(xì)胞上最佳TPCK-胰酶含量的確定將預(yù)試驗(yàn)制備的第一代種毒 10倍系列稀釋后接種懸浮MDCK細(xì)胞，分別加入TPCK-胰酶（分別含有2、4、8、12 μg·mL-1TPCK-胰酶），每個(gè)不同劑量的 TPCK-胰酶接種3組，每組接種3瓶，同時(shí)設(shè)1組不接毒的細(xì)胞對(duì)照，作為空白對(duì)照，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，將每組樣混勻后測其病毒含量（HA效價(jià)、TCID50以及EID50）。

2 結(jié)果

2.1 病毒在MDCK細(xì)胞上病毒增殖試驗(yàn)

2.1.1 MDCK細(xì)胞病變觀察 對(duì)細(xì)胞接毒前后細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接毒前細(xì)胞界限清晰，飽滿，接毒后32 h開始出現(xiàn)輕微病變，40—48 h圓縮聚集的細(xì)胞增多，56—64 h開始出現(xiàn)大量典型病變?cè)睿?xì)胞拉絲，崩解，至72 h細(xì)胞全部脫落（圖1、2）。

2.1.2 MDCK細(xì)胞預(yù)試驗(yàn)病毒含量 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，在64 h時(shí)，病毒含量可達(dá)最高，每1 mL病毒含量 106.5—107.0TCID50，每 0.1 mL 病毒含量 106.5—107.17EID50，HA效價(jià)為1∶32—1∶64，空白對(duì)照結(jié)果HA＜1∶2，TCID50、EID50均為0（表1）。

圖1 接毒前正常MDCK細(xì)胞Fig. 1 Normal MDCK cell before infection (200×)

圖2 接毒后64h的MDCK細(xì)胞Fig. 2 MDCK cell on 64h post-infection (200×)

2.1.3 MDCK細(xì)胞上培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.3.1 最佳接毒劑量（MOI）篩選 MOI為10-4，病毒含量可達(dá)最高，每 1 mL病毒含量 107.33—107.5TCID50，每0.1 mL病毒含量107.375— 107.5EID50，HA效價(jià)為1∶64—1∶128，空白對(duì)照結(jié)果HA＜1∶2，TCID50、EID50均為0（表2）。接毒百分比為0.008%，病毒含量可達(dá)最高，每 1 mL病毒含量 107.33—107.5TCID50，每0.1 mL病毒含量107.375—107.5EID50，HA 為 1∶64—1∶128，空白對(duì)照結(jié)果 HA＜1∶2，TCID50、EID50均為0（表3）。

2.1.3.2 最佳收毒時(shí)間篩選 在64h時(shí)，病毒含量可達(dá)最高，每1 mL病毒含量107.33—107.5TCID50，每0.1 mL病毒含量107.375—107.5EID50，HA效價(jià)為1∶64—1∶128，空白對(duì)照結(jié)果HA＜1∶2，TCID50、EID50均為0（表4）。

表1 病毒含量比較（HA、TCID50/mL、EID50/0.1 mL）Table 1 Comparison of virus titer (HA, TCID50/mL, EID50/0.1 mL)

表2 不同MOI病毒含量比較（HA、TCID50/mL、EID50/0.1mL）Table 2 Comparison of virus titer for different MOI (HA, TCID50/mL, EID50/0.1mL)

表3 不同接毒百分比病毒含量比較（HA、TCID50/mL、EID50/0.1mL）Table 3 Comparison of virus titer for different Take poison percentage (HA, TCID50/mL, EID50/0.1mL)

表4 不同收毒時(shí)間病毒含量比較（HA、TCID50/mL、EID50/0.1mL）Table 4 Comparison of virus titer in different times (HA, TCID50/mL, EID50/0.1mL)

2.1.3.3 最佳 TPCK-胰酶含量篩選 在 TPCK-胰酶濃度為2—4 μg mL-1，病毒含量可達(dá)最高，每1 mL病毒含量 107.33—107.5TCID50，每 0.1 mL病毒含量107.375—107.5EID50，HA 效價(jià)為 1∶64—1∶128，空白對(duì)照結(jié)果HA＜1∶2，TCID50、EID50均為0（表5）。節(jié)約成本考慮，TPCK-胰酶濃度選為2 μg mL-1。

2.1.3.4 最佳接毒方式篩選 無論吸附法還是直接接毒法，病毒含量均可達(dá)最高，每1 mL病毒含量107.33—107.5TCID50，每 0.1 mL 病毒含量 107.375—107.5EID50，HA效價(jià)為1∶64—1∶128，空白對(duì)照結(jié)果HA＜1∶2，TCID50、EID50均為0（表6）。節(jié)約時(shí)間考慮，選用直接接毒法。

2.1.3.5 最佳病毒代次篩選

（1）不同代次病毒的TCID50比較 測定結(jié)果表明, 第1—4代、6—13代的每1 mL病毒含量在107.0—108.0TCID50之間，第5代每1 mL病毒含量達(dá)到最高108.5TCID50，空白對(duì)照TCID50均為0（圖3）。

（2）不同代次病毒的 EID50比較 第 1—4代、6—13代的每0.1 mL病毒含量均在107.17—108.375EID50之間，第5代每0.1 mL病毒含量達(dá)到最高108.5EID50，空白對(duì)照EID50均為0（圖4）。

圖4 不同代次病毒EID50比較Fig. 4 Comparison of EID50 for viruses of different generations (EID50/0.1mL)

（3）不同代次病毒的HA效價(jià)比較 第1—3代、6—13代的HA效價(jià)在1∶64—1∶128之間，第4、5代HA效價(jià)可達(dá)最高1∶256，空白對(duì)照結(jié)果HA＜1:2（圖5）。

圖5 不同代次病毒HA效價(jià)比較Fig. 5 Comparison of HA for viruses of different generations

（4）不同代次病毒含量比較 禽流感病毒在MDCK細(xì)胞上連續(xù)傳代13代，第4、5代HA效價(jià)達(dá)到了1∶256，其他代次為1∶64—1∶128；第4、5代病毒含量穩(wěn)定在108.17—108.5EID50/0.1 mL，其他代次均能達(dá)到 107.17EID50/0.1 mL，病毒含量能達(dá)到107.0TCID50/mL，第3代以后均能保持在107.5TCID50/mL以上。貼壁型MDCK細(xì)胞培養(yǎng)禽流感病毒在HA效價(jià)上沒有明顯優(yōu)勢，僅第4、5代達(dá)到雞胚源毒種的國家標(biāo)準(zhǔn)。各代次病毒含量較為穩(wěn)定，基本都高于雞胚源國家標(biāo)準(zhǔn)（表7）。

表7 不同代次病毒含量比較（HA、TCID50/mL、EID50/0.1mL）Table 7 Comparison of virus titer of different generations (HA, TCID50/mL, EID50/0.1mL)

2.2 病毒在懸浮MDCK細(xì)胞上的增殖試驗(yàn)

2.2.1 MDCK細(xì)胞細(xì)胞病變觀察 對(duì)細(xì)胞接毒前后細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行了觀察，24—72 h開始出現(xiàn)細(xì)胞破碎，崩解，至72 h細(xì)胞全部脫落（圖6）。

2.2.2 病毒在懸浮MDCK細(xì)胞上病毒含量

2.2.2.1 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 雞胚毒在懸浮MDCK細(xì)胞上增殖，MOI取10-2，在48 h時(shí)，病毒含量可達(dá)最高，每1 mL病毒含量107.0TCID50，每0.1 mL病毒含量107.5EID50，HA效價(jià)為 1∶512，空白對(duì)照結(jié)果 HA＜1∶2，TCID50、EID50均為 0（表 8）。

圖6 接毒前后細(xì)胞病變情況Fig. 6 Pathological changes of cells before and after vaccination (200×)

2.2.2.2 懸浮MDCK細(xì)胞最佳接毒劑量 以上述試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，進(jìn)行懸浮毒傳代試驗(yàn)，結(jié)果表明 MOI取10-2為病毒HA效價(jià)、TCID50以及EID50最穩(wěn)定，最高（表9）。

表8 病毒含量比較（HA、TCID50/mL、EID50/0.1mL）Table 8 Comparison of virus titer (HA, TCID50/mL, EID50/0.1mL)

2.2.2.3 懸浮MDCK細(xì)胞最佳收毒時(shí)間 在48 h時(shí)，病毒含量可達(dá)最高，每 1 mL病毒含量 108.33—108.5TCID50，每0.1 mL病毒含量108.375—108.5EID50，HA效價(jià)為1∶512—1∶1024，空白對(duì)照結(jié)果HA＜1∶2，TCID50、EID50均為 0（表 10）。

2.2.2.4 最佳 TPCK-胰酶濃度試驗(yàn) 在 TPCK-胰酶濃度為 4—8 μg·mL-1，每 1 mL 病毒含量 108.0—108.5TCID50，每0.1 mL病毒含量108.17—108.5EID50，HA效價(jià)為1∶512—1∶1024,空白對(duì)照結(jié)果HA＜1∶2，TCID50、EID50均為0（表11）。節(jié)約成本考慮，TPCK-胰酶濃度選為 4—8 μg·mL-1。

3 討論

以生物反應(yīng)器大規(guī)模全懸浮培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)，已被許多大型知名企業(yè)應(yīng)用于病毒疫苗工業(yè)化生產(chǎn)，其生產(chǎn)規(guī)模已達(dá)數(shù)千升[17-18]，一些歐美國家已經(jīng)批準(zhǔn)，基于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的禽流感疫苗上市[19-21]，MDCK細(xì)胞最適宜生產(chǎn)甲型禽流感病毒和乙型禽流感病毒的三種細(xì)胞之一[22-23]。筆者的試驗(yàn)認(rèn)為，重組禽流感病毒在 MDCK細(xì)胞上增殖的試驗(yàn)從以下幾個(gè)方面進(jìn)行。

表9 不同MOI病毒含量比較（HA、TCID50/mL、EID50/0.1mL）Table 9 Comparison of virus titer for different MOI (HA, TCID50/mL, EID50/0.1mL)

表10 不同時(shí)間病毒含量比較（HA、TCID50/mL、EID50/0.1mL）Table 10 Comparison of virus titer in different times (HA, TCID50/mL, EID50/0.1mL)

表11 不同TPCK-胰酶濃度病毒含量比較（HA、TCID50/mL、EID50/0.1mL）Table 11 Comparison of virus titer in different TPCK-treated Trypsin concentrations (HA, TCID50/mL, EID50/0.1mL)

3.1 接毒方式

病毒接毒方式分別采用了病毒吸附法和直接接毒法，兩種方法病毒含量無差別，吸附法要進(jìn)行多次操作，較繁瑣，而直接接毒法，簡化了病毒繁殖操作，不但減少了操作時(shí)間，而且最大限度的降低了污染幾率，適用于規(guī)?；苽涠痉N。

3.2 接毒比例

一種是以MOI為接種單位，另一種以百分比為接種單位，在貼壁MDCK細(xì)胞中，以MOI為接種單位時(shí)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，過程比較繁瑣，而采用百分比接種法較為方便，但兩種方法獲得的種毒的病毒含量并無差別，在病毒繁殖中都適用，可根據(jù)不同試驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行不同的選擇。以百分比為接種單位需注意細(xì)胞傳代時(shí)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)與接種，以保證接毒時(shí)細(xì)胞的均一性。無論是以百分比為接毒單位，還是以MOI為接毒單位，其歸根結(jié)底都是病毒數(shù)量的不同，適當(dāng)?shù)牟《緮?shù)量可以更好地實(shí)現(xiàn)病毒的復(fù)制，從而更好的增殖[16]。當(dāng)病毒數(shù)量過多時(shí)，細(xì)胞在病毒的感染下迅速凋亡，破裂，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生大量不具有感染性的干擾缺損病毒顆粒，其基因組有缺損，故不能完成復(fù)制循環(huán)，而必須依賴于其同源的完全病毒才能復(fù)制。同時(shí)，由于基因組較其完全病毒小、復(fù)制更為迅速，在與其完全病毒共感染時(shí)更易占據(jù)優(yōu)勢，從而干擾其復(fù)制。當(dāng)病毒數(shù)量過低時(shí)，病毒增殖速度降低，病毒大量增殖時(shí)間延長，用于產(chǎn)毒的大部分細(xì)胞已老化，影響產(chǎn)毒，最終病毒含量也不高。

3.3 收毒時(shí)間

本試驗(yàn)對(duì)收毒時(shí)間進(jìn)行了篩選，確定了最佳的收獲時(shí)間，收獲的過早，病毒雖大量復(fù)制但未釋放，病毒含量較低，收獲時(shí)間過晚，細(xì)胞已完全破裂，死亡，病毒已沒有寄生的宿主，部分病毒會(huì)失去活性，影響病毒含量，當(dāng)細(xì)胞未死亡具有一定活性時(shí)，此時(shí)收獲病毒含量最高，可作為最佳的收獲時(shí)間。

3.4 TPCK-胰酶濃度

禽流感病毒感染細(xì)胞時(shí)需要先將 HA 基因裂解為 HA1 和 HA2 才能感染人或禽的細(xì)胞，這種裂解可以通過胰酶處理增加其感染性[24]。禽流感病毒在體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞，一般都需要在病毒增殖過程中添加經(jīng)TPCK處理的胰蛋白酶，能夠?qū)Σ《灸夷け砻娴腍A蛋白進(jìn)行正確裂解[25-26]。YOUIL等的研究發(fā)現(xiàn)TPCK-胰酶的存在與否對(duì)病毒增殖有很大影響，但隨著 TPCK-胰酶濃度增加對(duì)病毒增殖作用并沒有影響[27]。培養(yǎng)優(yōu)化中在確定最佳 TPCK-胰酶濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)，在濃度為 1—2 μg·mL-1范圍內(nèi)，病毒含量隨 TPCK-胰酶濃度的增加而上升，但2—4 μg·mL-1范圍內(nèi)，病毒含量無差別，出于成本考慮，將TPCK-胰酶濃度定為 2 μg·mL-1。在 TPCK-胰酶濃度為 6—8 μg·mL-1范圍內(nèi)，病毒含量很低，這是因?yàn)門PCK-胰酶濃度過大，除裂解病毒外，還對(duì) MDCK細(xì)胞單層產(chǎn)生了消化作用，致使細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)生了變化，部分細(xì)胞脫落，凋亡，病毒無法在細(xì)胞上有效增殖。

3.5 病毒培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)對(duì)不同代次的重組禽流感病毒 H7N9 H7-Re1的病毒含量進(jìn)行了比較，病毒經(jīng)過在 MDCK細(xì)胞上連續(xù)傳代，逐漸適應(yīng)細(xì)胞，CPE明顯、穩(wěn)定，病毒含量趨于穩(wěn)定。TCID50結(jié)果表明，病毒從第1代傳至第5代，TCID50總體呈上升趨勢，在第5代時(shí)達(dá)到最高，每1 mL病毒含量達(dá)到108.5TCID50，且重復(fù)性較好，產(chǎn)毒穩(wěn)定。病毒從第6代傳至第13代，TCID50總體呈下降趨勢，但下降幅度較小，1至13代，病毒TCID50先升后降，相差在1.5個(gè)滴度之內(nèi)，說明各代次之間TCID50相差較小。EID50結(jié)果表明，病毒從第1代傳至第5代，EID50總體呈上升趨勢，在第5代時(shí)達(dá)到最高，每0.1 mL病毒含量達(dá)到108.5EID50，且重復(fù)性較好，產(chǎn)毒穩(wěn)定，病毒從第6代傳至第13代，EID50總體呈下降趨勢，但下降幅度較小，1至13代，病毒EID50先升后降，相差在1.5個(gè)滴度之內(nèi)，說明各代次之間TCID50相差較小。HA效價(jià)結(jié)果表明，在第5代可達(dá)1∶256，相差在2個(gè)滴度之內(nèi)，各代次之間HA效價(jià)相差很小。在實(shí)際生產(chǎn)中我們結(jié)合了HI抗體測定及免疫攻毒的結(jié)果確定最佳生產(chǎn)用代次為第 5代。

4 結(jié)論

4.1 重組禽流感病毒H7N9 H7-Re1株各代次均可在MDCK細(xì)胞上穩(wěn)定增殖，利用MDCK細(xì)胞可大量增殖病毒，獲得高效價(jià)的毒種，降低污染幾率，但在MDCK細(xì)胞上隨著代次的增高HA基因、NA基因序列是否有所變化，發(fā)生突變這個(gè)問題值得思考，所以本試驗(yàn)對(duì)病毒傳代進(jìn)行了篩選，篩選出了最佳、最穩(wěn)定的低代次毒種，最大限度地降低了基因突變率。禽流感病毒在 MDCK細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)雖有多人對(duì)其進(jìn)行了研究[28-30]，但對(duì)H7亞型H7-Re1株在MDCK細(xì)胞上的培養(yǎng)優(yōu)化及病毒代次篩選未見報(bào)道，所以本試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了研究，篩選出了病毒最佳的培養(yǎng)條件、最佳代次，為生產(chǎn)制備高效價(jià)的疫苗奠定基礎(chǔ)。

4.2 通過懸浮MDCK細(xì)胞最佳接毒劑量、最佳收毒時(shí)間、最佳TPCK-胰酶濃度試驗(yàn)，為反應(yīng)器放大生產(chǎn)重組禽流感病毒滅活疫苗（細(xì)胞源）提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。重組禽流感病毒不應(yīng)在懸浮MDCK細(xì)胞上傳代超過5代，故在生產(chǎn)種毒庫的建立應(yīng)注意這一問題，選擇合適的種毒庫建立方法。

通過此試驗(yàn)提供兩種重組禽流感病毒在 MDCK細(xì)胞上馴化的方法，為生物反應(yīng)器大規(guī)模全懸浮培養(yǎng)禽流感滅活疫苗提供了有力的保證，兩種方法均可以放大用于生產(chǎn)。