懸浮MDCK細胞的馴化與H5亞型禽流感病毒的培養(yǎng)

陳宏，楊柳，宋海巖，石瑩，孟令偉，付春杰，張丹，趙海源，李金祥，蔣曉梅，張?zhí)焓?/p>

（1吉林冠界生物技術(shù)有限公司，吉林梅河口 135000；2中國農(nóng)業(yè)科學院，北京 100081；3新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院，烏魯木齊 830000）

0 引言

【研究意義】禽流感是由A型流感病毒引起的一種禽類感染或疾病綜合癥，A型流感病毒不僅對養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的危害[1]，同時具有直接感染人的能力，也給人類心理和身體健康造成巨大威脅[2]。為有效防控高致病性禽流感，我國采取對全國所有家禽進行強制免疫的政策[3]。【前人研究進展】目前國內(nèi)的禽流感疫苗生產(chǎn)工藝主要采用雞胚進行接種增殖，但這種生產(chǎn)工藝中，病毒連續(xù)傳代可能導致抗原性變異、雞胚存在可能的外源因子污染、尿囊液中雜質(zhì)多、雞胚殘體無害化處理成本高，如果禽流感暴發(fā)，雞群大量死亡，雞胚供應會成為瓶頸[4]，這種工藝將逐漸被基于動物細胞培養(yǎng)的生產(chǎn)工藝淘汰[5]。一些歐美國家，已經(jīng)批準基于動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的流感疫苗上市[6-8]。以哺乳動物細胞作為流感病毒增殖的基質(zhì)生產(chǎn)疫苗，具有重復性高、生產(chǎn)穩(wěn)定、抗原特性更接近自然株、變態(tài)反應少等優(yōu)勢[9]。成熟的動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)采用“細胞工廠”或微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)，其原理是增加細胞黏附生長的表面積來增加細胞密度[10]，雖然微載體懸浮培養(yǎng)能使細胞獲得較高的細胞密度，但其操作工藝繁瑣，增加了生產(chǎn)時間與生產(chǎn)成本[11]，應用具有局限性。【本研究切入點】MDCK細胞是最適于生產(chǎn)甲型流感病毒和乙型流感病毒的三種細胞之一[12-13]，可以生產(chǎn)安全有效的人用和獸用疫苗，產(chǎn)毒能力高。采用可連續(xù)培養(yǎng)傳代的MDCK懸浮細胞在生物反應器中進行禽流感病毒的大規(guī)模增殖制備，不但可以突破了各種限制，節(jié)約成本，還可大大提高培養(yǎng)密度和產(chǎn)物制備效率[14]，經(jīng)逐級放大培養(yǎng)后可以制備出有效、安全和高產(chǎn)量的流感病毒疫苗，是目前獸用疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域的前沿技術(shù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗中以馴化成功的懸浮MDCK細胞為基質(zhì)，增殖重組禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、H5N1 Re-8株，制備成三價滅活疫苗，免疫海蘭褐商品蛋雞和長白飛鴨，檢測血清中的 HI抗體效價，評估細胞源三價滅活疫苗的免疫效果。

1 材料與方法

本研究于2017年1—12月進行，商品蛋雞試驗在吉林省梅河口市得利雞場；商品鴨試驗在梅河口市方正鴨場。

1.1 材料

1.1.1 細胞株及病毒株 貼壁MDCK細胞由西北民族大學甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心從ATCC引進，引進時間：2011年2月，ATCC編號：CCL-34，代次：P56，保存號：58860056。

重組禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、H5N1 Re-8株購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.2 主要試劑

1.1.2.1 胎牛血清（FBS）、新生牛血清（NBS）購自蘭州民海生物工程有限公司；DMEM、DMEM/F12（1∶1）購自HyClone公司；生物素、氯化膽堿、維生素、葡萄糖、氨基酸等成分配制而成的MDCK無血清培養(yǎng)基，1%雞紅細胞懸液由吉林冠界生物技術(shù)有限公司制備；SPF雞胚購自梅里亞公司。

1.1.2.2 禽流感病毒H5亞型Re-6株、Re-7株和Re-8株 HI試驗抗原及陽性血清，均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 細胞搖床購自德國Eppendorf公司，倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司，5 L生物反應器購自艾貝泰公司，計數(shù)儀為 Count star全自動細胞計數(shù)儀。

1.1.4 試驗動物 海蘭褐蛋雞[15]6 050只；長白飛鴨[16]220只。

1.2 方法

1.2.1 懸浮MDCK細胞的馴化及生物學特性[17]。

1.2.1.1 馴化MDCK細胞適應低血清培養(yǎng) 在靜置培養(yǎng)的條件下，用含8% FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)MDCK細胞，逐步降低培養(yǎng)液中FBS的含量，至細胞適應含2% FBS的培養(yǎng)液。用NBS替代FBS，適應后將細胞消化轉(zhuǎn)移至搖床上培養(yǎng)（30 mL，30 r/min）,每天測定葡萄糖含量，低于1 g·L-1進行換液。待細胞比生長速率穩(wěn)定后，每次傳代前密度調(diào)整為約5.0×105cells/mL，并逐步提高搖床轉(zhuǎn)速。直至細胞完全失去黏附瓶壁的能力，以懸浮方式穩(wěn)定增殖。

1.2.1.2 馴化MDCK細胞適應無血清懸浮培養(yǎng) 以適應了2% NBS的MDCK細胞為基礎(chǔ)，逐步調(diào)整MDCK無血清培養(yǎng)基配方成分，直至完全適應MDCK無血清培養(yǎng)基。

1.2.1.3 無血清適應及在搖瓶中的生長情況 將MDCK細胞以1.5×106cells/mL的密度接種至250 mL Corning搖瓶中，培養(yǎng)體積為80 mL，轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng)基為MDCK無血清培養(yǎng)基。每24 h取樣監(jiān)測培養(yǎng)液中的葡萄糖含量并進行計數(shù)，繪制生長曲線。

1.2.1.4 在5L反應器中的生長情況 將MDCK細胞以1.5×106cells/mL的密度放大至5L反應器，有效培養(yǎng)體積為4 L，控制關(guān)鍵參數(shù)（溫度為（37±0.5）℃，pH 7.0±0.1，溶氧30%—50%，攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min），每 24 h取樣監(jiān)測培養(yǎng)液中的葡萄糖含量并進行計數(shù)，繪制生長曲線。

1.2.2 重組禽流感病毒的增殖

1.2.2.1 在懸浮MDCK細胞中的增殖 分別將重組禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株和H5N1 Re-8株按 MOI為 10-2接種至細胞密度為 4.5—5.0×106cells/mL，有效培養(yǎng)體積為4 L生物反應器，培養(yǎng)條件為溫度（34±0.5）℃，pH 7.3±0.1，溶氧30%—50%，攪拌轉(zhuǎn)速 150 r/min，TPCK-胰酶終濃度為 5 μg·mL-1。

1.2.2.2 在貼壁 MDCK細胞中的增殖 分別將重組禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株和H5N1 Re-8株按MOI為10-2接種至生長良好的MDCK細胞單層，培養(yǎng)條件為溫度34℃，TPCK-胰酶終濃度為 2 μg·mL-1。

1.2.3 病毒HA效價、TCID50、EID50的測定

1.2.3.1 HA效價測定 測定方法參照文獻[18]進行。

1.2.3.2 TCID50測定 將收獲的各重組禽流感病毒用DMEM培養(yǎng)基作10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-84個稀釋度，接種生長良好的MDCK細胞單層96孔培養(yǎng)板，每個稀釋度接種4孔，0.1 mL/孔，同時設(shè)正常細胞對照，置 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3—4 d，逐日觀察并記錄 CPE，按 Reed-Muench法計算TCID50。

1.2.3.3 EID50測定 將收獲的各重組禽流感病毒用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-83個稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1 mL，置36℃孵育72 h，逐個收獲雞胚液，分別測定HA效價，HA效價不低于1∶16判為感染，按Reed-Muench法計算EID50。

1.2.4 滅活疫苗的免疫 將上述以懸浮MDCK細胞為基質(zhì)生產(chǎn)的毒液制備成重組禽流感病毒（H5亞型）三價滅活疫苗（細胞源，Re-6株+ Re-7株+Re-8株），與雞胚源重組禽流感病毒（H5亞型）三價滅活疫苗（Re-6株+ Re-7株+Re-8株）分別在商品雞場與商品鴨場同時免疫，檢測禽流感HI抗體效價。

圖1 靜置培養(yǎng)條件下生長情況的比較Fig. 1 Comparison of growth under the condition of static

1.2.4.1 商品雞場 品種為海蘭褐商品蛋雞：6 050只，分為3組，2組為免疫組，每組3 000只，50只不免疫作為對照組，首次免疫：28日齡，0.5 mL/只；二次免疫：80日齡，0.5 mL/只；采血[19]時蛋雞日齡分別為49日齡、110日齡、210日齡，免疫組隨機采集50只血清樣本，對照組隨機采取10只，進行血凝抑制試驗，計算每組雞HI抗體效價幾何平均值（GMT）。

1.2.4.2 商品鴨場 品種為長白飛鴨，220只，分為3組，2組為免疫組，每組100只，不免疫對照組20只，同等條件下隔離飼養(yǎng)。首次免疫：10日齡，0.5 mL/只；二次免疫：24日齡，1.0 mL/只；采血時鴨日齡分別為24、38、52日齡，免疫組隨機采集20只血清樣本，對照組隨機采取10只血清樣本，每份血清樣本采用20%雞紅細胞吸附處理,本法采用0.5 mL血清與0.5 mL 20%雞紅細胞混合，輕振后，靜置60 min，吸取上清0.5 mL備用，進行血凝抑制試驗，計算每組HI抗體效價幾何平均值（GMT）

2 結(jié)果

2.1 馴化過程中MDCK細胞生長性能的比較

2.1.1 靜置培養(yǎng)條件下生長情況的比較 從最初培養(yǎng)液中血清濃度為8% FBS，逐步降低至2% NBS，培養(yǎng)液使用量均為10 mL，其細胞狀態(tài)見圖1-A和B，生長曲線比較見圖 1-C。經(jīng)長時間的馴化，細胞已適應低血清環(huán)境，生長速度雖比8% FBS組稍慢，但細胞狀態(tài)良好，活率（活細胞數(shù)/總細胞數(shù)）較高。

2.1.2 MDCK細胞馴化懸浮過程 細胞無血清全懸浮馴化初期，細胞幾乎不生長，活率也維持在一個較低的水平，經(jīng)過一段時間的適應傳代以及培養(yǎng)基組份的不斷調(diào)整，經(jīng)過4個不同培養(yǎng)體系，細胞逐漸適應并開始生長，細胞密度由（3.0—4.0）×106cells/mL，活率保持在90%以上；最終穩(wěn)定至細胞生長第3天時密度可達（7.0—8.0）×106cells/mL，活率保持在99%以上。MDCK細胞懸浮馴化過程細胞密度和細胞活率變化見圖2。

2.1.3 懸浮細胞傳代數(shù)據(jù) 馴化后的懸浮細胞凍存建庫保存，復蘇以后，通常第3天就可恢復生長，細胞密度（8.0—9.0）×106cells/mL，活率保持在99%以上。懸浮MDCK細胞復蘇后的細胞密度和細胞活率見圖3。

2.1.4 懸浮培養(yǎng)條件下的生長特性 在2% NBS靜置培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，不斷調(diào)整 MDCK無血清培養(yǎng)基成分，馴化出可高密度無血清懸浮培養(yǎng)的MDCK細胞，細胞倍增時間明顯縮短，形態(tài)近圓形、大小基本均一、單個懸浮于培養(yǎng)液中。以1.5×106cells/mL的細胞密度分別接種搖瓶和5 L反應器，每隔24 h取樣計數(shù)，繪制生長曲線，比較兩者的差異，見圖4。5 L反應器中增殖速度高于搖瓶，這是由于反應器的培養(yǎng)條件更為恒定，能為細胞的生長代謝提供更充分的氧并有效排除二氧化碳[20]。

圖2 MDCK細胞懸浮馴化過程細胞密度和細胞活率圖譜Fig. 2 Map of cell density and cell viability during MDCK cell acclimation and suspension

2.2 H5亞型重組禽流感病毒含量的比較

分別以貼壁及懸浮 MDCK細胞為基質(zhì)制備重組禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株和H5N1 Re-8株，病毒含量的結(jié)果比較見表 1。經(jīng)分析，兩種細胞制備的禽流感病毒含量相當，說明馴化的懸浮MDCK細胞對病毒的敏感性與貼壁細胞一致，適用于病毒的增殖。

圖3 懸浮MDCK細胞復蘇后的細胞密度和細胞活率圖譜Fig. 3 Cell density and cell viability map after the recovery of suspension MDCK cells

圖4 搖瓶及5 L反應器中生長情況Fig. 4 Growth in a shaker and 5 L reactor

表1 不同細胞制備的重組禽流感病毒含量比較Table 1 Comparison of the price of reassortant avian influenza virus produced by different cells

2.3 HI抗體測定結(jié)果

2.3.1 海蘭褐商品蛋雞 HI抗體結(jié)果 細胞源禽流感病毒滅活疫苗在商品雞場進行免疫試驗，免疫 21天后禽流感H5亞型 Re-6株、Re-7株、Re-8株平均抗體效價（GMT）分別為1∶446、1∶111、1∶416，首免后60 d雞群抗體有所下降，選擇在雞群80日齡進行二次免疫，二免后30 d HI抗體效價均能達到1∶588、1∶362、1∶776，210日齡三者平均抗體效價（GMT）分別為1∶239、1∶128、1∶223，維持了較高的抗體水平（表2）。

表2 海蘭褐商品蛋雞血清HI抗體結(jié)果Table 2 Results of Hy-line brown laying hens antibody(GMT)

2.3.2 長白飛鴨HI抗體結(jié)果 細胞源禽流感病毒滅活疫苗在商品鴨場進行免疫試驗，經(jīng)過兩次免疫，2周后禽流感H5亞型 Re-6株、Re-7株、Re-8株平均抗體效價（GMT）分別為1∶194、1∶91、1∶137，4周后平均抗體效價（GMT）可達到1∶416、1∶128、1∶239?？蓪喨寒a(chǎn)生保護（表3）。

表3 長白飛鴨血清HI抗體結(jié)果Table 3 Results of Changbai flying duck HI antibody (GMT)

3 討論

利用動物傳代細胞生產(chǎn)禽流感疫苗，可在短期內(nèi)大規(guī)模增殖病毒，在疫病爆發(fā)時提供足夠的疫苗產(chǎn)品，降低了病毒在雞胚中連續(xù)傳代而引起HA基因發(fā)生變異的概率，使疫苗的免疫效果更可靠。MDCK懸浮細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，可以有效擴大細胞的生長密度，既保留禽流感病毒在其中的增殖優(yōu)勢，又克服其產(chǎn)量低的缺點[21]。

試驗中采用逐步降低血清含量并調(diào)整無血清培養(yǎng)基配方的方法，在整個馴化過程中經(jīng)過了4種體系的逐步適應，最終獲得可無血清懸浮培養(yǎng)的 MDCK細胞，此株細胞能夠穩(wěn)定連續(xù)傳代，適應高密度生長，細胞保持較高的活力，從搖瓶放大至 5L反應器，生長穩(wěn)定。此研究掌握了一種MDCK懸浮細胞馴化的方法，其他貼壁細胞的馴化也可借鑒此類方法。此細胞株對重組禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、H5N1 Re-8株均敏感，病毒在其上的增殖能力與貼壁型 MDCK相當，可獲得較高的病毒滴度；但貼壁型MDCK增殖病毒的操作過程繁瑣、同一批次不同細胞瓶中病毒的滴度也存在差異、時間成本大。利用MDCK懸浮細胞生產(chǎn)的病毒產(chǎn)量遠遠高于貼壁培養(yǎng)，且同一批次的病毒質(zhì)量更均一穩(wěn)定，為后續(xù)逐級放大至6000L反應器奠定了基礎(chǔ)。

家禽的日齡、品種及飼養(yǎng)管理條件不同，對疫苗免疫的敏感性也不一致，HI抗體效價產(chǎn)生的時間和所能達到的 HI抗體水平及維持時間也存在相應的差別[22]。以此株懸浮細胞為基礎(chǔ)制備禽流感滅活疫苗，在商品雞場進行免疫試驗，28日齡首次免疫，21天后禽流感H5亞型 Re-6株、Re-7株、Re-8株平均抗體效價（GMT）分別為1∶446、1∶111、1∶416，首免后50—60 d抗體有所下降，因此選擇在80日齡進行二免，210日齡三者平均抗體效價（GMT）分別為1∶239、1∶128、1∶223，維持了較高的抗體水平。鴨的高致病性禽流感免疫一般需要二次接種才能產(chǎn)生較高的抗體水平[23]。不同日齡的蛋鴨經(jīng)免疫接種后抗體效價并不一致[24]，如果血清抗體效價在免疫接種臨界值1∶32—1∶64之間，就需要接種免疫；如果血清抗體效價在1∶64以上，可以不接種免疫[25]。商品鴨場進行的免疫試驗，52 d時禽流感 H5亞型Re-6株、Re-7株、Re-8株平均抗體效價（GMT）分別為1∶416、1∶128、1∶239，從這個試驗可以看出試驗結(jié)果與雞胚源重組禽流感滅活疫苗免疫后誘導產(chǎn)生的HI抗體效價相當。

對于疫苗質(zhì)量，國家高度重視，農(nóng)業(yè)部頒布了疫苗制造規(guī)程和質(zhì)量標準，并對疫苗生產(chǎn)企業(yè)采取了嚴格的管理措施和市場準入制度，為疫病的防控起到了重要作用[26]。對于重組禽流感病毒滅活疫苗的生產(chǎn)，凡是采用濃縮工藝的，疫苗的效力明顯好于非濃縮工藝。因此當抗原的血凝價達不到配制三價疫苗的要求時，需要進行適當?shù)臐饪s[27]。雞胚作為疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)，還存在大規(guī)模生產(chǎn)時供給困難、潛在的外源病毒污染以及批間差異較大的問題[28]，相信隨著生物技術(shù)的不斷進步，新的技術(shù)將會不斷的用于禽流感疫苗的生產(chǎn)，新型禽流感疫苗將會不斷推出[29]。利用連續(xù)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)流感疫苗其優(yōu)點為可規(guī)?；焖俅罅可a(chǎn)，易于質(zhì)量控制，純度高，穩(wěn)定性好[30]，將會成為未來的禽流感滅活疫苗生產(chǎn)的主要工藝。

4 結(jié)論

以本文所述方法馴化的 MDCK懸浮細胞為基礎(chǔ)制備禽流感滅活疫苗，商品雞在免疫后 21 d禽流感H5亞型Re-6株、Re-7株、Re-8株平均抗體效價（GMT）均達到或高于國家標準。在80日齡進行二免，210日齡后測定三者平均抗體效價均超過國家標準維持較高的抗體水平。長白飛鴨二次免疫后平均抗體效價也均達到或是超過國家標準。因此該生產(chǎn)工藝可用于禽流感滅活疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。