卵巢癌中MPC2的表達及其生物學功能

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌和宮體癌而位居第三位，但卵巢癌死亡率占各類婦科腫瘤的首位，對女性生命造成嚴重威脅［1］。目前積極的手術治療和放化療等基礎治療使得卵巢癌患者的生存狀況較前有所好轉，但5年生存率較低［2］，所以尋找潛在并有效的治療靶點迫在眉睫。

丙酮酸是糖類、脂肪和氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐，機體細胞整體代謝狀態(tài)往往取決于丙酮酸的代謝去向［3］。對于正常細胞，在有氧條件下丙酮酸進入線粒體被代謝，在無氧環(huán)境中，丙酮酸在胞質中經糖酵解形成乳酸。但是，腫瘤細胞即使在有氧狀態(tài)下，葡萄糖生成的丙酮酸依然通過糖酵解途徑代謝，這就是著名的Warburg效應［4］。雖然Warburg效應被提出了很多年，但是其中的具體機制尚不清楚。線粒體丙酮酸載體（mitochondirial pyruvate carrier，MPC）是介導丙酮酸穿越線粒體膜的重要蛋白，由MPC1和MPC2組成［5?6］。作為介導丙酮酸進入線粒體的重要蛋白，MPC在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中是否存在重要的病理生理作用知之甚少。

本研究首先利用http：//kmplot.com/analysis/數據庫分析卵巢癌組織中MPC1和MPC2的mRNA表達水平與患者生存預后的關系，結果顯示MPC2表達水平與患者的預后顯著相關。由于MPC2與卵巢癌的顯著相關性，因此著重研究MPC2在卵巢癌中的作用，通過體外細胞實驗以及檢測臨床病例組織標本中MPC2的表達情況，分析MPC2與各臨床病理參數以及患者生存預后的關系，并探討MPC2在卵巢癌細胞中的生物學作用，從而為進一步深入研究MPC2在卵巢癌中的作用提供臨床和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院2009年1月至2011年12月137例卵巢上皮源性惡性腫瘤患者手術切除的組織標本臨床病理資料。所有病例術前均未接受化療及放療，且術后組織標本均經病理確診為卵巢癌?；颊吣挲g19～83歲，中位年齡59歲；組織學分級為高、中分化腺癌59例，低分化腺癌78例；臨床分期早期患者49例，晚期88例；其中出現(xiàn)腹水患者90例，遠處轉移78例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色及評分 多克隆抗體MPC2（abcam，ab10391）購自美國Abcam公司，免疫組織化學專用一抗稀釋液、辣根過氧化物酶標記通用二抗（PV?6000）及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組織化學染色采用SP二步法，抗體稀釋液（1:100）稀釋一抗MPC2，4℃孵育過夜，室溫下通用型二抗孵育1 h，DAB顯色2 min。免疫組織化學判斷原則：綜合考慮陽性細胞數和陽性強度，采用半定量方法，依據陽性細胞比例評分為0分（0）、1分（1%～25%）、2分（26%～50%）、3分（51%～100%），并依據著色強度為分0分（無著色）、1分（淡黃色）、2分（棕黃色）及3分（棕褐色），每張切片于熱點區(qū)域隨機選取5個高倍視野評分，最后依據染色結果并按評分結果將兩項分值相乘后所有病例劃分為兩組，0～3分為低表達組，4～9分為高表達組。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及過表達MPC2細胞系的構建 卵巢癌細胞系OVCAR3和SKOV3均用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)，于37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。過表達MPC2的OVCAR3和SKOV3穩(wěn)定細胞所需系質粒購自深圳華大基因科技服務有限公司。

1.2.3 Western blot檢測MPC2過表達水平 取對數生長期的細胞，RIPA裂解液提取細胞蛋白，用BCA法測量蛋白濃度并統(tǒng)一上樣量，SDS?PAGE凝膠電泳90 min，Bio?Rad裝置濕轉蛋白于PVDF膜上，17 mA轉膜過夜，切取含目的條帶的PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。孵育MPC2抗體（1:2 000）與GAP?DH內參抗體（美國Santa Cruz公司，1:5 000）4℃過夜，TBST洗膜10 min×3次，室溫孵育二抗（1:10 000）1 h，再用TBST洗膜10 min×3次，ECL顯影。采用Im?age J軟件分析細胞內MPC2的表達量。

1.2.4 細胞增殖實驗 取對數生長期細胞，首先用0.05%的胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液，細胞計數，以每孔0.2 mL（細胞濃度1×104/mL）細胞接種于96孔板，分別在24、48、72及96 h時間點取出96孔板，每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT（3?4，5?dimethyl?thiazol? 2? yl）? 2，5? diphenyl? 2H? tetrazolium bro?mide），孵育4 h后棄液，再向每孔中加入150μL DMSO，震蕩10 min，用酶標儀于490 nm處檢測各孔的OD值，繪制生長曲線。

1.2.5 細胞克隆形成實驗 制備單細胞懸液，接種于6孔板中，取細胞濃度為1×104/mL 0.1 mL，加入細胞培養(yǎng)液4.9 mL。細胞靜置培養(yǎng)10～14 d，當6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS清洗3次，加入甲醇原液于?20℃冰箱中固定克隆6 min，0.1%結晶紫溶液室溫染色30 min。在光學顯微鏡（×40倍）下計數＞50個細胞的克隆數，并統(tǒng)計克隆形成數量。

1.2.6 Transwell實驗 取對數生長期細胞，制備單細胞懸液，離心后用不含血清的培養(yǎng)液重懸細胞計數，在小室中加入取1 mL細胞濃度為1×104/mL細胞液，在24孔板中加入500μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，將小室放在24孔板中；培養(yǎng)24 h后，取出小室用棉簽擦拭小室內部，結晶紫染色后在顯微鏡下采集圖像，計數細胞，進行侵襲遷移細胞數量統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，MPC2表達水平與患者臨床病理指標之間的相關性分析用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan?Meier法，單因素分析采用Log?rank檢驗，多因素分析采用Cox比例風險模型。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MPC1和MPC2 mRNA對腫瘤患者生存預后的影響

首先利用http：//kmplot.com/analysis/網站中的數據，分析MPC1和MPC2的基因表達水平對卵巢癌患者總生存期和無進展生存預后的影響。結果發(fā)現(xiàn)，MPC1 mRNA的水平表達對卵巢癌患者的無進展生存期（progression?free survival，PFS）（圖1A）和總生存率（overall survival，OS）（圖1B）的影響差異均無統(tǒng)計學意義；但是，MPC2 mRNA低表達的患者不論是PFS（圖1C）還是OS（圖1D）均較差。

圖1 MPC1和MPC2 mRNA對患者生存預后的影響

2.2 MPC2在卵巢癌組織中的表達及其與患者臨床病理指標之間的關系

基于前期數據庫分析的結果，MPC1對卵巢癌患者的生存影響不顯著，本研究主要關注MPC2在卵巢癌中的作用。通過免疫組織化學染色方法檢測MPC2在137例卵巢癌組織中的表達水平，結果顯示MPC2主要表達于腫瘤細胞的細胞質內，而癌旁正常的卵巢間質細胞及表面上皮內則少有表達（圖2A），137例卵巢癌組織中MPC2高表達45例（32.8%）、低表達92例（67.2%）。分析患者年齡、分化程度、臨床分期、遠處轉移及腹水等臨床病理指標與MPC2表達水平的關系，發(fā)現(xiàn)MPC2的表達水平與腹水的產生（χ2=4.54，P=0.037）、遠處轉移（χ2=8.31，P=0.004）及臨床分期（χ2=17.13，P＜0.001）有關，MPC2低表達的患者臨床分期較高（圖2B）、但MPC2的表達水平與患者的病理分級無關（圖2C），MPC2低表達的患者易伴有腹水（圖2D）和遠處轉移（圖2E）。且MPC2的表達水平與患者年齡無顯著相關性（表1）。

2.3 MPC2表達水平與卵巢癌患者生存預后的關系

采用Kaplan?Meier法對137例卵巢癌病例行統(tǒng)計學分析，單因素生存分析顯示，臨床分期為早期的患者總生存率顯著優(yōu)于晚期患者（P=0.04，圖3）。單因素分析MPC2表達水平與患者生存預后的關系結果顯示，MPC2低表達的患者總體預后較差（P=0.03）。Cox比例風險模型多因素分析結果顯示，MPC2低表達是卵巢癌患者不良預后的獨立風險因素（HR=2.40，P=0.01，表2）。

圖2 MPC2在卵巢癌組織中的表達及其與臨床病理指標之間的關系

表1 MPC2的表達水平與患者臨床病理參數之間的關系

2.4 過表達MPC2對卵巢癌細胞增殖和遷移的影響

在卵巢癌細胞系OVCAR3和SKOV3中轉染過表達質粒MPC2，并篩選過表達MPC2的穩(wěn)定細胞系（圖4A）。應用MTT法分別檢測MPC2過表達細胞和對照組細胞的生長情況。結果顯示過表達MPC2的兩種卵巢癌細胞在第3天和第4天的OD值均低于對照組細胞（P＜0.05，圖4B）。通過二維平板克隆形成實驗及Transwell侵襲遷移實驗分別檢測MPC2的表達對腫瘤細胞克隆形成及遷移能力的影響，結果顯示MPC2過表達可以顯著抑制細胞的克隆形成，且MPC2過表達可以顯著抑制細胞的侵襲遷移能力（圖4C）。組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4D）。

圖3 臨床分期及MPC2對患者生存預后的影響

表2 多因素分析各指標對137例卵巢癌患者預后的影響

圖4 過表達MPC2對卵巢癌細胞生物學行為的影響

3 討論

上皮性卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，世界范圍內卵巢癌每年新發(fā)病人數與死亡人數均較高［7?8］。多數患者雖然經外科手術有效切除腫瘤，但因出現(xiàn)化療藥物耐藥以及腫瘤的復發(fā)和轉移，致使卵巢癌復發(fā)率高和預后不良［9?10］。因此尋找有效的治療卵巢癌的潛在靶點以及監(jiān)測預后的標記物迫在眉睫。

失控性增殖是腫瘤的基本特征，腫瘤細胞為了滿足自身增殖的需要，經常會出現(xiàn)代謝的重組［11］。腫瘤細胞即使在氧氣充足時，依然優(yōu)先通過糖酵解途徑產能，這種供能方式即“Warburg效應”［12］。這種特有的能量獲取方式已在多種腫瘤細胞中得到驗證，成為腫瘤的重要特征之一［13］。即便經過多年的研究，Warburg效應的發(fā)生機制一直未有合理的解釋。為什么腫瘤細胞在有氧狀態(tài)下依然將丙酮酸轉化為乳酸，而不是轉運到線粒體進行有氧代謝？丙酮酸進入線粒體需要線粒體丙酮酸轉運載體蛋白MPC的參與［14］，可見MPC在腫瘤細胞代謝重組過程中可能發(fā)揮著重要作用。MPC是由MPC1和MPC2組成共同組成的蛋白復合體，目前關于MPC在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中的作用研究較少。MPC蛋白在惡性腫瘤中的作用不一致，一項中樞神經系統(tǒng)膠質瘤的研究中發(fā)現(xiàn)伴有IDH1突變的膠質瘤病例中MPC1高表達的患者預后明顯好于MPC1低表達者，相反MPC2蛋白高表達者生存率低于MPC2低表達患者［15］。由此可見MPC1和MPC2在同一類型腫瘤中所起作用并不一致。本研究首先利用http：//kmplot.com/analysis/數據庫分析卵巢癌組織中MPC1和MPC2 mRNA表達水平與患者生存預后的關系，結果顯示MPC1表達水平對患者生存預后的影響差異無統(tǒng)計學意義，但MPC2表達水平與患者的預后顯著相關，MPC2高表達的患者其生存率明顯高于低表達。由此可見MPC家族成員在卵巢癌與膠質瘤中的研究結論并不一致，提示MPC1和MPC2在不同組織起源的腫瘤中所起作用不同。本研究重點探討MPC2在上皮源性卵巢惡性腫瘤中的作用。通過免疫組織化學染色方法檢測發(fā)現(xiàn)MPC2在卵巢癌組織中的表達水平與腫瘤的惡性進展密切相關，MPC2低表達的患者臨床分期較高、易產生腹水和遠處轉移；并且MPC2低表達是卵巢癌患者不良預后的獨立預測因子。通過對137例卵巢癌患者的預后分析，單因素生存分析發(fā)現(xiàn)MPC2低表達的患者預后較差，并且多因素生存分析結果也表明MPC2是卵巢癌患者獨立的預后因素。MPC2在卵巢癌中的作用與MPC1在低級別神經膠質腫瘤中的作用類似，MPC2表達比率高提示患者可能生存率高，這就提示MPC2有望成為未來監(jiān)測卵巢癌患者預后的影響因子之一。但MPC如何調控腫瘤細胞的代謝重塑過程，且不同活性的MPC蛋白在不同細胞種類中如何發(fā)揮其調控作用仍需進一步研究證實［16］。

已有報道［14］MPC1基因在結腸癌組織中的表達低于相對應的正常組織，MPC2在結腸癌組織中低表達，且與不良預后相關。本研究經免疫組織化學染色方法檢測發(fā)現(xiàn)MPC2蛋白在卵巢癌組織中的表達均比正常卵巢間質細胞及表面上皮高，提示MPC2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能存在細胞代謝的重組調控，致使MPC2表達較正常組織有所升高。腫瘤細胞中能量代謝重塑是使腫瘤進展及細胞轉化的關鍵因素，已有研究報道［6］證實重新過表達MPC可以導致癌細胞的干性特征減弱，這就進一步證明了MPC活性降低或缺失是癌細胞發(fā)揮其致癌作用所必須的關鍵步驟。有研究結論已證實結腸癌組織中MPC蛋白表達下降，且MPC低表達和不良預后有關［17］。另外一項前列腺癌的研究報道也提出MPC1和MPC2陽性表達是良好預后的標記之一［18］。這些研究結論與本研究中發(fā)現(xiàn)MPC2的低表達與卵巢癌的惡性進展密切相關結論相同。正常機體細胞主要以氧化磷酸化的方式供能，源于這種產能方式所提供的能量比糖酵解途徑要多，為何腫瘤細胞通過糖酵解的方式代謝是當前研究細胞能量代謝的重點領域，MPC將丙酮酸運載至線粒體起核心作用，為研究MPC對卵巢癌細胞能量代謝及生物學功能的影響作用，本實驗利用體外細胞實驗檢測卵巢癌細胞系中增加MPC2的表達后對細胞生長及運動能力的影響，結果顯示MPC2可以顯著抑制細胞的增殖和遷移能力。MPC2低表達在卵巢癌中是如何促進腫瘤惡性進展及其對腫瘤細胞能量代謝轉化并重塑的具體分子機制，尚需進一步深入研究證實。本研究結論提示MPC2在卵巢癌惡性進展過程中可能起著重要作用，而且MPC2低表達可以作為卵巢癌患者不良預后的獨立預后指標，MPC2可抑制卵巢癌細胞的生長及侵襲遷移能力，MPC2在包括卵巢癌在內的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，且MPC2低表達具有一定的普遍性，逆轉MPC2表達可影響腫瘤細胞能量代謝轉化，MPC2有可能成為未來腫瘤生物治療中的潛在靶點。