小棗黑疔病拮抗放線菌的篩選與發(fā)酵優(yōu)化

洪 亮, 楊麗芬, 楊 建 *, 郭建偉, 程加省

(1. 紅河學(xué)院云南省農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 蒙自 661100; 2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】棗樹因耐貧瘠、耐旱、耐鹽堿，成為山、沙、堿、旱地區(qū)重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)林樹種，中國山東、河北、山西、河南、新疆等省種植面積達(dá)133.3 萬hm2左右，干棗成為中國第一大干果。蒙自小棗為云南蒙自一種古老的地方性棗樹 (ZiziphusjujubaMill)品種，適宜于微堿性的輕壤土[1]。據(jù)報(bào)道，截止2004年云南紅河州蒙自縣、建水縣等地區(qū)已種植蒙自小棗、金絲小棗等1000萬hm2，爆發(fā)有棗銹病、棗瘋病、黑斑病、縮果病、裂果病、爛果病等，其中棗縮果病、黑斑病或黑疔病(爛果病一種)的病原菌為細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)或細(xì)交鏈格孢(Alternariaalternata)[2-6]，普遍發(fā)生于新疆、山西、河北、山東、云南、天津等中國棗主產(chǎn)區(qū)，重則發(fā)病率達(dá)30 %。棗黑疔病的防治對(duì)中國棗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】放線菌是一類能產(chǎn)生2/3以上的臨床應(yīng)用及農(nóng)用生物活性代謝產(chǎn)物(如酶、抗生素等)的重要微生物[7]，因而篩選動(dòng)、植物病害拮抗放線菌成為發(fā)現(xiàn)生防菌株的有效途徑。目前，已有防治腐霉菌(Pythiumspp)、鐮刀菌(Fusariumspp)、疫霉菌(Phytophthoraspp)和絲核菌(Rhizoctoniaspp)等多種植物病原菌的市場化放線菌活菌劑及抗生素制劑[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以紅河州蒙自小棗黑疔病鏈格孢菌(Alternariasp.)為靶標(biāo)，以大慶油田土壤12株及臭靈丹17株、腎茶26株內(nèi)生放線菌為供試菌株，采用濾紙片法篩選高拮抗菌株，繼而進(jìn)行碳氮源、碳氮比、溫度、時(shí)間等發(fā)酵條件的優(yōu)化，并初步探索活性物質(zhì)的極性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究結(jié)果將獲得棗黑疔病高拮抗放線菌，優(yōu)化發(fā)酵條件并探明活性物質(zhì)的極性，為生防菌劑開發(fā)及抗菌活性物質(zhì)的分離奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病原菌：鏈格孢菌(Alternariasp.)，分離自患有黑疔型爛果病的蒙自小棗。

供試放線菌：大慶油田土壤放線菌12株、臭靈丹內(nèi)生放線菌17株、腎茶內(nèi)生放線菌26株，總計(jì)55株。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、張攀等培養(yǎng)JY-22的最佳培養(yǎng)基(SIM)[9]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試拮抗菌株的篩選 以PDA液體培養(yǎng)基接種鏈格孢菌，180 r/min、28 ℃培養(yǎng)2 d，過濾并調(diào)整孢子濃度為1×106 cfu/mL，備用；以SIM液體培養(yǎng)基接種放線菌，180 r/min、28 ℃培養(yǎng)7 d，過濾并取濾液12 000 r/min離心15 min，取上清液備用。取150 μl鏈格孢菌菌懸液涂布在PDA培養(yǎng)基上，然后在每個(gè)平板上放置直徑0.6 cm的無菌圓濾紙片，每片濾紙片上滴加30 μl放線菌離心上清液，以SIM液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，28 ℃對(duì)峙培養(yǎng)7～15 d，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，于第7～15天測量抑菌帶寬度。以拮抗活性最高的菌株作為發(fā)酵條件優(yōu)化供試菌株。

1.2.2 碳氮源優(yōu)化 碳源優(yōu)化：分別以等質(zhì)量的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉作為碳源替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的可溶性淀粉。

氮源優(yōu)化：分別以等質(zhì)量的硫酸銨、硝酸銨、酵母粉、黃豆粉、蛋白胨、硝酸鉀、干酪素等作為氮源替代SIM中的黃豆粉、酵母粉或蛋白胨。

碳氮比優(yōu)化(C/N比)：以篩選的最佳碳源、氮源替代SIM中相應(yīng)碳源、氮源，設(shè)置2/18、2/20、2/22、2/24、2/26等5個(gè)梯度(本文章中C/N比僅代表供試替換碳源與氮源的質(zhì)量比，即N質(zhì)量不包括SIM中另2種氮源)。

上述研究均采用28 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，取培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液離心液(去除菌體)測試抑菌圈直徑。

1.2.3 發(fā)酵溫度優(yōu)化 以上述研究的最佳培養(yǎng)基接種供試放線菌，設(shè)置22、24、26、28、30 ℃等5個(gè)溫度梯度，180 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)7 d測試抑菌圈直徑。

1.2.4 發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化 以最佳培養(yǎng)基接種供試放線菌，最佳發(fā)酵溫度培養(yǎng)，在第3～11天逐日取樣測試發(fā)酵液抑菌圈直徑。

1.2.5 活性物質(zhì)極性測試 取發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)中第6天的發(fā)酵液300 mL，高速離心去除菌體經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，然后以等量80 %乙醇40 ℃浸泡48 h，然后依次用氯仿、乙酸乙酯萃取，靜置過夜，乙酸乙酯相、氯仿相、乙醇相均需經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，再取干物質(zhì)的1/20分別以15 mL氯仿、乙酸乙酯、無菌水溶解，最后分別取30 μl氯仿相、乙酸乙酯相、乙醇相、離心發(fā)酵液滴加在無菌濾紙片上，待有機(jī)溶劑揮發(fā)后，取濾紙片測試抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的篩選

從55株放線菌中篩選到2株鏈格孢拮抗菌，分離自腎茶根部的內(nèi)生放線菌BEG-46第7、15天的抑菌直徑分別為13.6、8.1 mm；分離自臭靈丹莖部的內(nèi)生放線菌BAJ01第7、15天的抑菌直徑分別為6.1、3.2 mm，因而以BEG-46作為供試菌株優(yōu)化發(fā)酵條件。

2.2 碳氮源優(yōu)化

如圖2所示，最佳碳源為抑菌圈直徑達(dá)13.0 mm的葡萄糖，其次是作為對(duì)照SIM中的可溶性淀粉(抑菌圈直徑10.4 mm)；如圖3所示，以酵母粉替代黃豆粉、蛋白胨的抑菌圈直徑分別達(dá)16.1 mm、13.7 mm，最佳氮源為酵母粉；如圖4所示，最佳C/N比為2∶20，抑菌圈直徑達(dá)22.2 mm。因而優(yōu)化后的SIM培養(yǎng)基成分為：葡萄糖2 g，酵母粉20 g，蛋白胨2 g，NaCl 4 g，CaCO34 g。

圖1 BEG-46發(fā)酵液對(duì)鏈格孢菌的拮抗作用Fig.1 The antagonism of strain BEG-46’s fermentation broth on Alternaria sp.

圖2 碳源對(duì)BEG-46菌株抑菌活性的影響 Fig.2 Antaganistic effect of carbon sources on BEG-46

1.基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氮源，2.硫酸銨替換黃豆粉，3.硫酸銨替換酵母粉，4.硫酸銨替換蛋白胨，5.硝酸銨替換黃豆粉，6.硝酸銨替換酵母粉，7.硝酸銨替換蛋白胨，8.酵母粉替換黃豆粉，9.酵母粉替換蛋白胨，10.黃豆粉替換酵母粉，11.黃豆粉替換蛋白胨，12.蛋白胨替換黃豆粉，13.蛋白胨替換酵母粉，14.硝酸鉀替換黃豆粉，15.硝酸鉀替換酵母粉，16.硝酸鉀替換蛋白胨，17.干酪素替換黃豆粉，18.干酪素替換酵母粉，19.干酪素替換蛋白胨圖3 氮源對(duì)BEG-46菌株抑菌活性的影響Fig.3 Antaganistic effect of nitrogen sources on BEG-46

圖4 碳氮比對(duì)BEG-46菌株抑菌活性的影響Fig.4 Antaganistic effect of C/N ratio on BEG-46

2.3 發(fā)酵溫度優(yōu)化

如圖5所示，BEG-46菌株在28 ℃以前隨溫度的增加抑菌性增強(qiáng)，在30 ℃時(shí)發(fā)酵液抑菌活性急劇下降。因此，28 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)BEG-46菌株抑菌活性的影響Fig.5 Antaganistic effect of temprature on BEG-46

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)BEG-46菌株抑菌活性的影響Fig.6 Antaganistic effect of fermentation time on BEG-46

2.4 發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化

如圖6所示，發(fā)酵第7天之前抑菌圈直徑隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，第7天的時(shí)達(dá)到最大值22.7 mm，而后隨發(fā)酵時(shí)間的增加而減小。因此，第7天為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.5 活性物質(zhì)極性測試

如表1所示，抑菌活性物質(zhì)存在于乙醇相，表明抑菌活性物質(zhì)極性較大。

3 討 論

研究表明，微生物次生代謝產(chǎn)物的合成與培養(yǎng)基成分、溫度、發(fā)酵時(shí)間等培養(yǎng)條件密切相關(guān)，其次生代謝產(chǎn)物濃度在不同的培養(yǎng)條件下相差達(dá)400倍[10]；在培養(yǎng)基中添加不同的金屬離子可以影響其次生代謝產(chǎn)物的多樣性及量的積累[11]。本研究從55株放線菌篩選2株鏈格孢拮抗菌株，其中BEG-46拮抗活性較高，其最佳發(fā)酵條件：優(yōu)化SIM培養(yǎng)基成分為葡萄糖2 g，酵母粉20 g，蛋白胨2 g，NaCl 4 g，CaCO34 g，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間為7 d，相對(duì)原培養(yǎng)條件抑菌活性提高了118.3 %。結(jié)果表明，碳源為葡萄糖時(shí)抑菌活性較強(qiáng)，優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件顯著提高了BEG-46的抑菌活性。這與張攀等[9]、Monaghan等[10]研究結(jié)果一致，但相對(duì)張攀等[9]氮源成分減少為酵母粉、蛋白胨，減少了工業(yè)化生產(chǎn)的操作環(huán)節(jié)從而節(jié)省時(shí)間提高生產(chǎn)效率，對(duì)利用微生物菌劑防治云南小棗黑疔病病菌鏈格孢具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。但尚有不足之處，如趙瑩等[12]以當(dāng)?shù)亓畠r(jià)易得的大豆粉作為優(yōu)化培養(yǎng)基的氮源，本研究采用的酵母粉、蛋白胨在工業(yè)化生產(chǎn)中加工成本高，或許以云南本地廉價(jià)易得的玉米粉、蠶豆粉等作為替代氮源，實(shí)際應(yīng)用的意義更大；此外，趙瑩等[12]還研究了優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)拮抗菌株生物量的影響，王再強(qiáng)等[13]探討了云南廉價(jià)的玉米淀粉等7種碳源及4種氮源對(duì)拮抗菌株生物量和抑菌活性的影響，張正蕓等[11]探討了金屬離子對(duì)活性菌株次生代謝產(chǎn)物量積累的影響，柳成賓等[14]以響應(yīng)面法探索了轉(zhuǎn)速、初始pH值、接種量、裝液量等對(duì)拮抗菌株抑菌活性的影響。因而，瞄準(zhǔn)更為廉價(jià)的氮源、金屬離子、轉(zhuǎn)速、初始pH值、接種量、裝液量等對(duì)拮抗菌株BEG-46生物量及抑菌活性的影響問題開展后續(xù)研究，開發(fā)成本低、抑菌活性強(qiáng)的生防菌劑創(chuàng)造條件。本研究發(fā)現(xiàn)抑菌活性物質(zhì)的極性較大，易溶于水，這與邵光燦等[15]的研究結(jié)果一致，為該生防菌次生代謝物的分離提供了依據(jù)。BEG-46對(duì)小棗黑疔病鏈格孢具有高拮抗活性，并且其抑菌活性物質(zhì)極性高、易溶于水，具有防治紅河州小棗黑疔病鏈格孢的應(yīng)用潛力。

表1 抑菌活性物質(zhì)的極性分析

4 結(jié) 論

通過濾紙片法從55株放線菌中篩選到2株鏈格孢拮抗菌，其中分離自腎茶根部的內(nèi)生放線菌BEG-46第7天的抑菌直徑達(dá)13.6 mm；經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后的發(fā)酵條件為葡萄糖2 g，酵母粉20 g，蛋白胨2 g，NaCl 4 g，CaCO34 g，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間為7 d；優(yōu)化條件下的BEG-46發(fā)酵液抑菌活性相對(duì)原培養(yǎng)條件提高了118.3 %；其活性物質(zhì)極性高、易溶于水。