低磷脅迫條件下大豆磷高效近等基因系主要農(nóng)藝性狀分析

劉 萍，董文漢，王明君，尹元萍，董蓉嬌，張 慧，梁 泉 *

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201)

【研究意義】大豆是重要的糧、油、飼兼用作物，也是人們?nèi)粘Ｉ钪袃?yōu)質(zhì)蛋白和食用油的主要來(lái)源。大豆是喜磷作物，磷不僅是大豆遺傳物質(zhì)的重要組成成分，同時(shí)參與了大豆的光合作用、呼吸作用、能量轉(zhuǎn)化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物大分子合成以及酶活性的調(diào)節(jié)等，在大豆整個(gè)新陳代謝過(guò)程中扮演著十分重要的角色[1]。雖然土壤中的磷含量很高，但大多數(shù)磷都不能被植物直接吸收利用，其有效性較低，難以滿足大豆生長(zhǎng)的需要[2]。中國(guó)土壤中效態(tài)磷含量不足30 mg/kg，而大豆可利用的磷往往不足土壤磷的50 %[1-2]。華南地區(qū)的酸性紅壤上，磷素對(duì)大豆產(chǎn)量的影響尤甚[4-5]。【前人研究進(jìn)展】大豆磷效率遺傳改良是解決土壤磷供應(yīng)不足的經(jīng)濟(jì)而有效途徑[2]。傳統(tǒng)的育種方法由于手段單一，在改良諸如磷效率等數(shù)量性狀上有很大的局限性[2-4]。對(duì)大豆磷效率進(jìn)行遺傳改良，需要了解大豆高效吸收利用磷的生理和分子機(jī)制，從外源種質(zhì)資源中發(fā)掘和利用新的優(yōu)良基因資源[1]。構(gòu)建近等基因系是解析植物對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)機(jī)制的有效途徑。近等基因系(Near Isogenic Lines，NILs)是指一組遺傳背景相同或相近，而某個(gè)特定性狀或其遺傳基礎(chǔ)有差異的一組品系。最早應(yīng)用NILs的報(bào)道是關(guān)于大豆根瘤方面的研究[5]。近年來(lái)，應(yīng)用NILs在作物遺傳育種[6-7]、QTL精細(xì)定位和基因功能研究[8-9]等方面發(fā)揮了重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)以2個(gè)在根形態(tài)性狀和磷效率等方面具有顯著差異的大豆品種BD2和BX10為親本材料，采用回交和自交法，經(jīng)表型結(jié)合與根形態(tài)構(gòu)型相關(guān)磷高效密切連鎖的SSR標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，在BC5F3獲得含5個(gè)單株的磷高產(chǎn)QTLs高代材料，它與輪回親本BX2構(gòu)成了大豆根形態(tài)構(gòu)型相關(guān)磷高效近等基因系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在低磷脅迫條件下考察該NILs株高、生育期、葉面積、葉柄夾角、產(chǎn)量及其構(gòu)成因素等特性的表達(dá)差異，旨在了解根形態(tài)構(gòu)型相關(guān)磷高效QTLs的導(dǎo)入和表達(dá)對(duì)大豆生物學(xué)性狀的影響，為未來(lái)生理生化和基因克隆研究提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用2個(gè)在根系性狀和磷效率方面差異較大的大豆品種作為親本材料，分別是巴西引進(jìn)品種“巴西10號(hào)”(BX10)，廣東博羅縣地方品種“本地2號(hào)”(BD2)。

BD2來(lái)源于廣東省博羅縣，是當(dāng)?shù)仄毡樵耘嗟霓r(nóng)家品種。BX10來(lái)源于巴西，是一個(gè)高度栽培化的長(zhǎng)青春期大豆品種，淺根型，粒大，生物量較高，豐產(chǎn)性較好。而BD2則具有較多的原始性狀，植株半蔓生，深根型，粒小，生物量和產(chǎn)量較低。以根形態(tài)構(gòu)型和磷吸收效率等為指標(biāo)，BD2為深根、磷低效敏感型，而BX10為淺根、高效不敏感型[3,10]。

1.2 構(gòu)建方法

以磷低效和深根型的BD2為輪回親本，以磷高效和淺根型的BX10為供體親本，采用連續(xù)回交、自交法和異地穿梭加代，春季在昆明種植回交后代，每個(gè)后代單株選取15～20朵花去雄，并授以BD2花粉，秋季在云南元江縣(東經(jīng)102°00′，北緯23°59′，海拔880 m)種植回交后代，并在苗期提取葉片DNA，以根系形態(tài)構(gòu)型相關(guān)磷高效的特異性SSR標(biāo)記[11]進(jìn)行輔助選擇，收獲時(shí)挖掘根系觀察，收獲后抽樣進(jìn)行室內(nèi)水培驗(yàn)證，表型、特異性SSR標(biāo)記和室內(nèi)水培驗(yàn)證相結(jié)合，1年完成1個(gè)世代，包括回交和后代檢測(cè)。這樣反復(fù)進(jìn)行，回交5次，然后選單株自交、鑒定，于2015年秋季得到包含A2、A4、A5、A6、A8共計(jì)5個(gè)磷高效相關(guān)根形態(tài)構(gòu)型近等基因系株系，5個(gè)株系共有326粒種子，并加代繁殖形成326個(gè)家系。

1.3 田間試驗(yàn)和性狀調(diào)查

試驗(yàn)在石林縣板橋鎮(zhèn)進(jìn)行。土壤pH值5.54，有機(jī)質(zhì)34.6 g/kg，全氮1.467 g/kg，全磷1.62 g/kg，全鉀8.96 g/kg，堿解氮105.4 mg/kg，速效磷5.08 mg/kg，速效鉀113.7 mg/kg。設(shè)高磷(160 kg/hm2)和低磷(不施磷)2水平，氮、鉀肥料用量(純量)，分別為：N75 kg/hm2，K2O 60 kg/hm2。N、P、K分別由尿素、普鈣和氯化鉀提供。P、K統(tǒng)一作底肥一次性施用，尿素分2次追施。

從上述近等基因系A(chǔ)2、A4、A5、A6、A8等5個(gè)株系BC5F3群體中，每個(gè)家系取40粒種子共計(jì)種植200株，對(duì)照BD2種植200株，供體親本BX10種植200株，每個(gè)小區(qū)每個(gè)家系(含BD2、BX10)分別種植10粒種子，4重復(fù)，其中：高磷處理為1個(gè)重復(fù)，低磷處理3次重復(fù)。

按照國(guó)家大豆區(qū)試調(diào)查記載標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查株高、生育期、產(chǎn)量及其構(gòu)成因素。

在初花期，每株系取樣3株進(jìn)行調(diào)查測(cè)定。

葉柄夾角(Leaf stalk angle, LAN)：倒三葉葉柄與莖垂直線的夾角，單位用“°”表示，每小區(qū)每個(gè)家系取2株共計(jì)10株測(cè)量，取平均值。

葉面積(leaf area, LAR)：應(yīng)用 CI-203手持式激光葉面積儀測(cè)量大豆葉片面積，記錄各個(gè)葉片的面積值(cm2)，在低磷處理每小區(qū)每家系取樣1株共計(jì)5株，取平均值。

表1 低磷條件下親本和NILs群體中的葉面積及葉柄夾角

圖1 低磷條件下磷高效根形態(tài)構(gòu)型近等基因系群體中葉面積的頻率分布Fig.1 Frequency distribution of LAR in the NILs for root traits morphology and architecture related to high phosphorus-efficient at low phosphorus conditions

生物量和根冠比：初花期，低磷處理每小區(qū)每家系取樣1株共計(jì)5株，高磷處理每個(gè)家系取樣3株，田間挖掘完整植株、清洗干凈，分根、地上部(莖、葉)殺青、烘干和稱重，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉面積和葉柄夾角

在低磷條件下對(duì)雙親及NILs群體中葉面積和葉柄夾角進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表1、圖1～2)。

從表1和圖 1～2中發(fā)現(xiàn)雙親在葉面積和葉柄夾角上存在較大差異，供體親本葉面積較受體親本大12.3 %，葉柄夾角則是受體親本的1.87倍；150個(gè)NILs單株中，群體葉面積平均值31.762 cm2，與輪回親本BD2接近，變異系數(shù)為21.2 %，總體上偏向于BD2；150個(gè)NILs單株中，群體葉柄夾角平均值58.036°，與輪回親本BD2接近，變異系數(shù)為14.6 %，總體上偏向于BD2；葉面積和葉柄夾角均呈連續(xù)分布，說(shuō)明這2個(gè)性狀屬多基因控制的數(shù)量性狀，同時(shí)存在超親(輪回親本)分離的現(xiàn)象，但總體上偏向于輪回親本(圖1～2)。

2.2 生物量

雙親和NILs群體植株生物量和根冠比的比較見(jiàn)圖3。供體親本BX10的植株生物量總是高于BD2，其中低磷條件下高18.9 %、高磷條件下高36.6 %，說(shuō)明BD2對(duì)介質(zhì)磷濃度不敏感，屬低效、遲鈍型(徐青萍等，2003)(10)；2種磷水平下，NILs平均植株干重均處于雙親之間，其中：低磷條件下其生物量與BX10差異不顯著，但與BD2差異顯著；高磷條件下其生物量與BX10差異顯著，與BD2差異達(dá)顯著水平(圖3-A)；2種磷水平下，NILs根冠比處于雙親之間，其中：低磷條件下其根冠比與BX10差異不顯著，但與BD2差異顯著；高磷條件下BX10、BD2、NILs三者之間根冠比的差異均未達(dá)到顯著水平(圖3-B)。說(shuō)明經(jīng)過(guò)多次回交后，NILs群體雖然基本恢復(fù)至輪回親本BD2水平，但由于導(dǎo)入了供體親本BX10高效磷相關(guān)根形態(tài)構(gòu)型的基因，在植株生長(zhǎng)勢(shì)、根系性狀等方面要優(yōu)于輪回親本BD2。

2.3 主要農(nóng)藝性狀

低磷和高磷2種處理?xiàng)l件下，NILs和輪回親本BD2株高、生育期、產(chǎn)量及其構(gòu)成因素(分枝數(shù)、總莢數(shù)、粒數(shù)、百粒重等)的比較見(jiàn)表2。NILs和輪回親本BD2在株高、生育期性狀上無(wú)差異：低磷條件下NILs平均株高55.91 cm、BD2則為54.62 cm，高磷條件下NILs平均株高分別為56.54和54.87 cm，NILs群體的5個(gè)株系間在高、低磷條件下均無(wú)顯著差異；低磷條件下NILs生育期平均為103.2 d、BD2則為102 d，高磷條件下則分別為103.6和103 d，NILs群體的5個(gè)株系間在高、低磷條件下均無(wú)顯著差異。

圖2 低磷條件磷高效根形態(tài)構(gòu)型近等基因系群體中葉柄夾角的頻率分布Fig.2 Frequency distribution of LAN in the NILs for root traits morphology and architecture related to high phosphorus-efficient at low phosphorus conditions

同一處理的差異性采用t 檢驗(yàn)，同列數(shù)字后不同小寫字母表示不同品系間差異顯著(P<0.05)The difference comparison used the t test in the same treatment, data with different small letters in the same column indicated significant difference at 0.05 level圖3 雙親和磷高效根形態(tài)構(gòu)型近等基因系群體植株生物量和根冠比Fig.3 The plant dry weigh and root-shot ratio of the parents and the NILs population for root traits morphology and architecture related to high phosphorus-efficient

NILs與輪回親本BD2之間在分枝數(shù)和百粒重上均無(wú)顯著差異：在低磷條件下，NILs群體5個(gè)株系分枝數(shù)和百粒重平均值分別為3.32個(gè)和15.38 g，變幅分別為3.40～3.68個(gè)、14.88～15.79 g，變異系數(shù)分別為3.04 %和2.38 %，而BD2則分別為3.05個(gè)和15.24 d；在高磷條件下，NILs群體5個(gè)株系分枝數(shù)和百粒重平均值分別為3.42個(gè)和15.86 g，變幅分別為3.66～4.24個(gè)、15.41～16.32 g，變異系數(shù)分別為5.68 %和2.67 %，而BD2則分別為3.16個(gè)和15.56 d。說(shuō)明經(jīng)多代回交和選擇后，NILs基本回歸至輪回親本水平，同時(shí)也表明大豆分枝和百粒重主要由遺傳因素決定，磷營(yíng)養(yǎng)對(duì)其影響較小。

NILs與輪回親本BD2之間在單株產(chǎn)量、總莢數(shù)、總粒數(shù)上均呈顯著或極顯著差異。在低磷條件下，NILs群體5個(gè)株系單株產(chǎn)量平均值為9.35 g，變幅為8.78 ～10.36 g，變異系數(shù)為8.0 %， BD2單株產(chǎn)量為7.64 g，NILs較BD2增17.76 %，A6、A8株系與BD2之間差異顯著，A2、A4、A5與BD2間差異達(dá)極顯著水平；5個(gè)株系單株莢數(shù)平均值為39.82個(gè)，變幅為37.2～42.4個(gè)，變異系數(shù)為8.72 %， BD2單株莢數(shù)為35.12個(gè)，NILs較BD2增13.38 %，A6、A8株系與BD2之間差異顯著，A2、A4、A5與BD2間差異達(dá)極顯著水平；5個(gè)株系單株粒數(shù)平均值為61.84粒，變幅為59.2～65.9粒，變異系數(shù)為10.76 %， BD2單株粒數(shù)為52.46粒，NILs較BD2增17.88 %，A6、A8株系與BD2之間差異顯著，A2、A4、A5與BD2間差異達(dá)極顯著水平。

表2 2種磷水平下近等基因系及輪回親本主要農(nóng)藝性狀

注：*和**分別表示在0.05 %和0.01 %水平上差異顯著。

Note:*and **indicated significant difference atP≤5 % andP≤1 % level respectively.

在高磷條件下，NILs群體5個(gè)株系單株產(chǎn)量平均值為12.36 g，變幅為11.22～13.26 g，變異系數(shù)為6.1 %， BD2單株產(chǎn)量為10.23 g，NILs較BD2增20.82 %；5個(gè)株系總莢數(shù)平均值為49.88個(gè)，變幅為44.5～55.3個(gè)，變異系數(shù)為8.81 %， BD2單株莢數(shù)為43.24個(gè)，NILs較BD2增15.36 %；5個(gè)株系單株粒數(shù)平均值為77.42粒，變幅為73.8～83.4粒，變異系數(shù)為7.04 %，BD2單株粒數(shù)為64.56粒，NILs較BD2增19.92 %。說(shuō)明由于供體親本BX10優(yōu)良基因的導(dǎo)入，顯著改善了NILs的產(chǎn)量及其相關(guān)性狀。

無(wú)論低磷還是高磷條件下，NILs群體中5個(gè)株系之間在株高、分枝數(shù)、單株產(chǎn)量、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)、百粒重等性狀差異均未達(dá)顯著水平；5個(gè)株系之間在株高、生育期、分枝數(shù)、百粒重等性狀上，高磷條件與低磷條件下基本接近；與低磷條件相比，高磷時(shí)NILs單株產(chǎn)量、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)分別增32.19 %、25.26 %和25.19 %，而BD2則分別增28.84 %、23.12 %和23.07 %。說(shuō)明磷營(yíng)養(yǎng)顯著影響大豆產(chǎn)量。

3 討 論

利用近等基因系可以最大限度地降低遺傳背景差異，從而提高對(duì)QTL的定位、檢測(cè)能力以及分子標(biāo)記輔助育種等[8,12]。Clark首次應(yīng)用大豆近等基因系研究根瘤，其后近等基因系被廣泛應(yīng)用于作物遺傳與育種、基因精細(xì)定位和基因功能等研究。近等基因系的構(gòu)建方法主要有回交法[13-15]、突變體分離法[16]、分子標(biāo)記輔助導(dǎo)入法[6,8,17-18]和高世代分離法等[9,19]。

回交法是最常用方法，供本親本與受體親本雜交，在其后的各分離世代中每代均選擇包含目標(biāo)基因/性狀的植株與受體親本回交，連續(xù)回交4～6代，最后自交1～2代，從中篩選獲得具有目標(biāo)基因/性狀的植株，該植株除了保留供體親本的目標(biāo)性狀外，其遺傳背景與輪回親本相近，這樣輪回親本與該選育材料互為近等基因系。從理論上說(shuō)，要從近等基因系中消除來(lái)自親本供體的染色體位點(diǎn)需要多次回交，在回交過(guò)程中，除了目標(biāo)性狀基因的轉(zhuǎn)移外，盡可能快速、完整地恢復(fù)輪回親本的基因組成是構(gòu)建近等基因系的關(guān)鍵。一般而言，經(jīng)過(guò)5～6次回交即可育出近等基因系[12]。但是，回交法工作量大、周期長(zhǎng)、選擇效率低。近年來(lái)，利用分子標(biāo)記進(jìn)行目標(biāo)性狀的前景選擇和輪回親本的背景選擇，可以快速、準(zhǔn)確構(gòu)建目標(biāo)性狀基因(QTL)的近等基因系。

本研究在前期工作中，利用2個(gè)在磷效率相關(guān)根系性狀顯著差異的大豆品種為材料構(gòu)建磷效率相關(guān)根系性狀重組自交系[3,20]，應(yīng)用SSR標(biāo)記在B1、C1、D1a、D2和F連鎖群上初步定位了7個(gè)位點(diǎn)的磷效率相關(guān)根系性狀QTLs[3,21]，再在上述7個(gè)位點(diǎn)兩側(cè)合成100對(duì)SSR引物進(jìn)一步篩選，并結(jié)合田間試驗(yàn)、水培試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，最終獲得磷高效相關(guān)根形態(tài)構(gòu)型性狀特異性SSR標(biāo)記21對(duì)[11]。本研究仍以上述2個(gè)親本為材料，應(yīng)用回交法和特異性SSR標(biāo)記輔助選擇，結(jié)合田間表型性狀對(duì)回交分離后代進(jìn)行有效選擇和鑒定，最終獲得5個(gè)株系326個(gè)家系的磷高效相關(guān)根形態(tài)構(gòu)型性狀基因(QTL)的近等基因系。經(jīng)田間低磷條件下鑒定，與受體親本比較，在葉面積、葉柄夾角、株高、生育期、分枝數(shù)、百粒重等性狀上差異不顯著，但在單株產(chǎn)量、單株莢數(shù)和單株粒數(shù)等性狀上存在顯著或極顯著差異，而 NILs內(nèi)部5個(gè)株系之間差異不顯著，上述性狀一致性較高，是較理想的近等基因系。

根是作物從土壤中吸收養(yǎng)分的唯一途徑。長(zhǎng)期生長(zhǎng)在低磷脅迫環(huán)境條件下，高等植物會(huì)形成一些適于土壤磷吸收的適應(yīng)機(jī)制，包括根形態(tài)特征的演變(如根毛形成)、誘導(dǎo)酸性磷酸酶以及特異根系分泌物的形成和分泌等。許多研究結(jié)果表明，作物根形態(tài)構(gòu)型可以作為作物磷效率的一個(gè)重要指標(biāo)和遺傳改良的重要方向[22-27]。土壤磷素有效性低和利用率不高嚴(yán)重影響了大豆的產(chǎn)量與分布。以大豆磷高效相關(guān)根形態(tài)構(gòu)型近等基因系為材料，進(jìn)一步揭示根系形態(tài)構(gòu)型對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)以及相關(guān)的生理特征和分子機(jī)制，將有助于指導(dǎo)大豆磷營(yíng)養(yǎng)的遺傳改良工作，在提高大豆產(chǎn)量和品質(zhì)以及實(shí)現(xiàn)化肥、農(nóng)藥“兩個(gè)零增長(zhǎng)”的目標(biāo)發(fā)揮實(shí)質(zhì)性的作用。

4 結(jié) 論

采用回交和自交法，經(jīng)表型并結(jié)合與根形態(tài)構(gòu)型相關(guān)磷高效密切連鎖的SSR標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，得到的BC5F3代近等基因系其葉面積和葉柄夾角呈連續(xù)分布，并偏向于輪回親本，在株高、生育期、葉面積、分枝數(shù)、百粒重等性狀上已基本回歸到輪回親本水平，但在低磷條件下其根冠比、單株產(chǎn)量、單株莢數(shù)和單株粒數(shù)等與受體親本差異顯著，株系間差異不顯著，一致性程度較高，是較理想的近等基因系。

致謝:感謝華南農(nóng)業(yè)大學(xué)根系生物學(xué)研究中心和云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院在大豆根系性狀掃描分析上提供的幫助。