純合o2o2背景下玉米胚乳硬質(zhì)度與賴氨酸含量的遺傳研究

齊建雙，谷利敏，夏來坤

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002)

優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)玉米(QPM)中富含賴氨酸和色氨酸，其生物效應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比普通玉米高。我國(guó)自20世紀(jì)70年代初開始研究?jī)?yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)玉米，先后培育出了一大批的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)玉米品種，但這些品種均未得到大面積推廣種植，原因是這些品種多多少少都存在一定的缺陷?？傮w來說，我國(guó)早期育成的高賴氨酸玉米品種的賴氨酸含量達(dá)標(biāo)，但胚乳硬質(zhì)度不達(dá)標(biāo)，由于籽粒容重下降，這類品種產(chǎn)量比普通玉米低10%左右；近期育成的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)玉米品種有的是胚乳硬度達(dá)標(biāo)，賴氨酸含量稍低，也有少部分品種是賴氨酸和胚乳硬度都達(dá)標(biāo)，但種植范圍有限制，在夏季高溫多雨的地區(qū)因易感穗腐病而無法種植。由此可見，優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)玉米在o2o2純合背景下表現(xiàn)出來的籽粒容重低、粉質(zhì)不透明、易感穗腐病等不良性狀一直是影響其大面積推廣種植的一個(gè)瓶頸問題。為解決這一難題，國(guó)內(nèi)外研究人員進(jìn)行了大量研究。1969年，Paez等[1]首先發(fā)現(xiàn)o2胚乳修飾基因Opm，將Opm導(dǎo)入o2突變體后選育出高賴氨酸的QPM，其籽粒賴氨酸含量達(dá)到 0.40%以上，同時(shí)胚乳硬質(zhì)度也大大提高。但由于Opm包含多個(gè)遺傳位點(diǎn)，導(dǎo)致Opm的修飾效應(yīng)不同，不同遺傳背景(也有的認(rèn)為是不同粒型)的材料含有o2修飾基因的數(shù)量不同，改良效果也不盡相同[2-4]。石德權(quán)等[5]、楊引福等[6]、宋同明等[7]從修飾基因的利用實(shí)踐中指出，修飾基因的頻率決定o2玉米胚乳透明度，增加胚乳硬質(zhì)度，雖籽粒物理性狀得到改良，但賴氨酸含量有下降趨勢(shì)。2010年，據(jù)美國(guó)物理學(xué)家組織網(wǎng)(http：//phys.org)報(bào)道，美國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)，γ醇溶蛋白(γ-zein)會(huì)使玉米籽粒更加堅(jiān)硬。2016年Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)玉米胚乳發(fā)育過程中，27 ku γ-zein的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平是野生型和o2突變體的 2～3倍，RNAi沉默后優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)玉米籽粒重新由硬質(zhì)變?yōu)檐涃|(zhì)，同時(shí)證明了27 ku γ-zein的調(diào)控因子(qγ27)為順式調(diào)控元件，屬于基因劑量效應(yīng)調(diào)控。27 ku γ-zein 基因所在的QTL是調(diào)控修飾o2胚乳最重要的位點(diǎn)之一[9]。也有研究想直接避開胚乳硬質(zhì)度和賴氨酸含量的矛盾，如高樹仁[10]認(rèn)為，以普通玉米與o2玉米自交系組配雜交種是一種值得探討的高賴氨酸玉米選育方法。關(guān)于這個(gè)問題的研究還有很多，這些研究總結(jié)起來一致認(rèn)為，賴氨酸含量與胚乳的硬質(zhì)程度呈負(fù)相關(guān)，這是一對(duì)事實(shí)存在的矛盾。但對(duì)在o2o2純合背景下賴氨酸含量與胚乳硬質(zhì)度表達(dá)的研究還相對(duì)比較薄弱。鑒于此，選用遺傳背景清晰、育種上廣泛應(yīng)用的幾個(gè)材料及其組合進(jìn)行研究，揭示純合o2o2背景下玉米胚乳硬質(zhì)度與賴氨酸含量的遺傳規(guī)律，為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)玉米育種提供一定的借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

普通玉米骨干自交系鄭58、昌7-2和掖478以及由它們作為輪回親本回交轉(zhuǎn)育成的高賴氨酸近等基因系QZ58、QC72、Q478家系各10個(gè)；高賴氨酸供體自交系齊205、CA042；由齊205、QZ58、QC72和Q478根據(jù)雜種優(yōu)勢(shì)模式組配的組合4套，分別為QZ58×齊205、QZ58×QC72、QC72×QZ58和Q478×QC72。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn) 雜交組合組配：選長(zhǎng)勢(shì)一致的父本穗行混合取粉，與對(duì)應(yīng)的母本雜交，收獲時(shí)按行收獲考種，測(cè)量籽粒容重。F2代試驗(yàn)：按收獲的穗行種植，每個(gè)組合各種植10個(gè)穗行。采用與大田普通玉米錯(cuò)期播種的試驗(yàn)方案，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，4行區(qū)，3次重復(fù)。行長(zhǎng)4 m，行距0.6 m，株距0.25 m。每個(gè)雜交組合在邊行套袋自交6穗以備檢測(cè)籽粒賴氨酸含量，收獲時(shí)每小區(qū)取中間2行從第4株開始連續(xù)收獲10穗，進(jìn)行測(cè)產(chǎn)并測(cè)量籽粒容重。

1.2.2 分子標(biāo)記鑒定 SSR標(biāo)記選用齊建雙[4]已建立的MAS技術(shù)體系的o2基因內(nèi)標(biāo)記umc1066。

1.2.3 容重測(cè)定 按照GB/T 5498—2013測(cè)定。

1.2.4 賴氨酸含量測(cè)定 用MATRIX-I近紅外光譜分析儀采用籽粒無破損法測(cè)定。將收獲的F2代自交籽粒按照不同的雜交組合進(jìn)行混合，每個(gè)雜交組合取3份，每份混勻測(cè)量3次，求其平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標(biāo)記基因型鑒定

回交轉(zhuǎn)育的近等基因系基因型檢測(cè)以QC72家系為例(圖1)?；亟晦D(zhuǎn)育成的QC72家系在o2位點(diǎn)純合。同樣，QZ58和Q478家系在o2位點(diǎn)也都達(dá)到隱性純合。

2.2 雜交一代(F1)玉米胚乳硬質(zhì)度表現(xiàn)

隱形突變基因(例如sh2和wx)在接受了普通玉米的花粉后，會(huì)產(chǎn)生花粉直感使雜交后代籽粒變成普通玉米。同樣，o2o2基因純合材料在接受了普通玉米的花粉后，也會(huì)產(chǎn)生花粉直感使F1代種子表現(xiàn)為硬質(zhì)程度很高的普通玉米籽粒。但雙親均為o2o2基因純合且胚乳硬質(zhì)程度差別較大的2個(gè)自交系雜交，F(xiàn)1代種子胚乳硬質(zhì)度表現(xiàn)尚不明確。

在以往的研究[2-4]中已經(jīng)得知，o2o2基因純合試驗(yàn)材料中QC72家系的胚乳硬質(zhì)度比QZ58家系高得多。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，在o2o2背景下，2個(gè)近等基因系正反交得到的雜交F1代種子胚乳硬質(zhì)度存在較大差異：以胚乳硬質(zhì)度高的QC72家系作父本時(shí)，F(xiàn)1代籽粒的硬質(zhì)程度較低，與其母本QZ58家系接近；反過來，而以胚乳硬質(zhì)度高的QC72家系作母本時(shí)，F(xiàn)1代的籽粒胚乳硬質(zhì)度較高，與其母本QC72家系接近。這說明在o2o2基因純合背景下，F(xiàn)1代種子胚乳硬質(zhì)度具有母本效應(yīng)，沒有花粉直感效應(yīng)。這與Pixley[11]、楊引福等[12]、齊建雙等[13]的結(jié)論吻合。

P1：普通玉米自交系昌7-2； P2：高賴氨酸供體親本CA042； 95—102：QC72家系中的8個(gè)單株圖1 普通昌7-2及QC72家系SSR檢測(cè)結(jié)果

圖2 o2o2基因純合的QC72與QZ58家系正反交示意

2.3 不同雜種優(yōu)勢(shì)類群雜交組合F2代玉米籽粒容重、賴氨酸含量的方差分析

由表1、2可以看出，4個(gè)不同雜種優(yōu)勢(shì)類群雜交組合的重復(fù)之間容重和賴氨酸含量差異均不顯著。說明在o2o2基因純合背景下，雜交組合的籽粒胚乳硬質(zhì)度和賴氨酸含量受小環(huán)境影響不大，所以雜交組合之間胚乳硬質(zhì)度、賴氨酸含量的差異均由基因型差異引起。

表1 不同雜種優(yōu)勢(shì)類群雜交組合F2代玉米籽粒容重方差分析

表2 不同雜種優(yōu)勢(shì)類群雜交組合F2代玉米籽粒賴氨酸含量方差分析

2.4 不同雜種優(yōu)勢(shì)類群雜交組合近等基因系家系內(nèi)部F2代玉米籽粒容重、產(chǎn)量、賴氨酸含量的方差分析

在4個(gè)不同雜交類群雜交組合各10個(gè)近等基因系家系內(nèi)部，對(duì)F2代容重、產(chǎn)量和賴氨酸含量分別做方差分析，結(jié)果(表3)表明：不同雜交類群雜交組合家系內(nèi)部的雜交組合之間產(chǎn)量差異均未達(dá)到顯著水平，賴氨酸含量也只有Q478×QC72達(dá)到顯著水平。但雜交組合QZ58×齊205、QZ58×QC72、Q478×QC72近等基因系家系內(nèi)部容重差異均達(dá)到極顯著水平。也就是說，這4個(gè)雜交組合近等基因系家系內(nèi)部的10個(gè)穗行之間籽粒產(chǎn)量和賴氨酸含量差異均較小，只有容重存在較大差異。因此，在賴氨酸含量沒有顯著差異的QZ58×齊205、QZ58×QC72、QC72×QZ58中可以找到胚乳硬質(zhì)度較高的近等基因系家系雜交組合，解決賴氨酸含量與胚乳硬質(zhì)度的矛盾。

表3 不同雜種優(yōu)勢(shì)類群雜交組合近等基因系家系內(nèi)部F2代玉米容重、產(chǎn)量和賴氨酸含量的方差分析

注：*表示在5%水平顯著，**表示在1%水平極顯著，下同。

2.5 F2代籽粒賴氨酸含量與F1容重、F2容重之間的關(guān)系

對(duì)F1容重、F2容重與F2賴氨酸含量三者做相關(guān)分析，結(jié)果(表4)表明：F2代籽粒賴氨酸含量與F1容重、F2容重均呈負(fù)相關(guān)，但與F2容重未達(dá)到顯著水平，僅與F1容重達(dá)到了顯著水平，但決定系數(shù)(R2=10.24%)不大；F1容重與F2容重呈正相關(guān)，未達(dá)到顯著水平。由此可見，F(xiàn)2容重與F2賴氨酸含量之間沒有直接的決定關(guān)系，賴氨酸含量與胚乳硬質(zhì)度的關(guān)系并不十分密切。

表4 F1容重、F2容重與F2賴氨酸含量之間的相關(guān)性分析

2.6 不同雜種優(yōu)勢(shì)類群雜交組合F1容重、F2容重與F2賴氨酸含量平均值多重比較

從表5可見，4個(gè)不同雜種優(yōu)勢(shì)類群雜交組合F1容重平均值表現(xiàn)為QC72×QZ58組合極顯著高于QZ58×齊205、QZ58×QC72、Q478×QC72組合，QZ58×QC72、Q478×QC72組合顯著高于QZ58×齊205組合。F2容重平均值表現(xiàn)為Q478×QC72組合顯著高于QZ58×齊205、QZ58×QC72組合，極顯著高于QC72×QZ58組合。F2賴氨酸含量平均值表現(xiàn)為Q478×QC72組合顯著高于QC72×QZ58組合，極顯著高于QZ58×QC72組合，與QZ58×齊205組合差異不顯著。其中，雜交組合QZ58×QC72與QC72×QZ58是胚乳硬質(zhì)度有較大區(qū)別的2個(gè)親本的正反交組合，其F1容重存在極顯著差異，但F2代容重與F2代賴氨酸含量差異均未達(dá)到顯著水平。雜交組合Q478×QC72 F2代容重在4個(gè)類群雜交組合中最大，賴氨酸含量也最高，表明o2o2基因純合背景下雜交組合的容重和賴氨酸含量可以達(dá)到完美結(jié)合。

表5 不同雜種優(yōu)勢(shì)類群雜交組合的F1容重、F2容重與F2賴氨酸含量

注：同列不同大、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異極顯著、顯著。

3 結(jié)論與討論

玉米籽粒是玉米的主要儲(chǔ)藏器官，是玉米產(chǎn)量的直接決定因素，胚乳是主要的儲(chǔ)藏物積累場(chǎng)所[14]，胚乳的質(zhì)量直接決定著玉米的品質(zhì)。普通玉米的胚乳蛋白質(zhì)中有70%賴氨酸含量很低的醇溶蛋白，o2突變體能夠降低這類醇溶蛋白的合成，同時(shí)顯著增加非醇溶蛋白的含量，從而極大地提高籽粒中賴氨酸和色氨酸的含量[15-16]，進(jìn)而改善玉米胚乳的品質(zhì)。而玉米胚乳的硬質(zhì)度決定著玉米的儲(chǔ)藏品質(zhì)。因此，選育出賴氨酸含量高、胚乳硬質(zhì)度較高的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)玉米新品種才能滿足市場(chǎng)的需要。本研究結(jié)果表明，在純合o2o2背景下，F(xiàn)2代籽粒賴氨酸含量與F2代籽粒容重呈不顯著負(fù)相關(guān)，證明玉米籽粒胚乳硬質(zhì)程度與賴氨酸含量這對(duì)矛盾是可以化解的，這與胚乳修飾基因可以改變玉米籽粒胚乳硬質(zhì)度而賴氨酸含量不明顯降低的結(jié)論是一致的。因此，在育種的過程中，應(yīng)該選擇合適的遺傳材料(如硬粒型材料，在回交轉(zhuǎn)育的近等基因系后代中會(huì)出現(xiàn)從軟質(zhì)到硬質(zhì)的一系列胚乳變異[2])，同時(shí)注意胚乳修飾微效基因的頻率積累。

胚乳修飾基因自1969年被發(fā)現(xiàn)以來已有近50 a 的研究歷程，但研究進(jìn)展較慢且大部分研究集中在國(guó)外[17]，利用效率也較低。在我國(guó)，優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)玉米的主要研究方法還是通過分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合對(duì)普通玉米核心自交系進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育[3，18-19]，這種方法的局限性在于，在回交轉(zhuǎn)育的過程中不僅將高賴氨酸基因轉(zhuǎn)進(jìn)了普通玉米自交系，同時(shí)部分不利基因也會(huì)轉(zhuǎn)育進(jìn)去，導(dǎo)致回交轉(zhuǎn)育成的高賴氨酸近等基因系的配合力下降，利用效率降低。隨著轉(zhuǎn)基因等現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，利用更先進(jìn)的方式快速發(fā)掘胚乳修飾基因，將高賴氨酸基因和胚乳修飾基因同時(shí)轉(zhuǎn)入普通玉米自交系，將是未來優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)玉米育種的主要方向。