亞低溫通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活自噬改善蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠早期腦損傷

劉仁杰，劉俊杰，張堯，王婧瑤，王一超，張婧曦，梁文吉，趙雅寧，李建民

（華北理工大學(xué) 1. 附屬醫(yī)院神經(jīng)外科； 2. 臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 唐山 063000）

蛛網(wǎng)膜下腔出血 （subarachnoid hemorrhage，SAH） 是一種常見(jiàn)的神經(jīng)外科急癥，致死率、致殘率高，發(fā)病多見(jiàn)于中青年，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命［1］。減輕早期腦損傷是治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減少神經(jīng)細(xì)胞的丟失［2］。自噬可維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活［3］。并且眾多學(xué)者認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)自噬的激活有顯著作用［4-5］。目前亞低溫作為一種新型治療方法，通過(guò)控制性降低患者核心溫度以保護(hù)器官免受損傷影響，在實(shí)驗(yàn)研究及外科手術(shù)中得到了廣泛應(yīng)用，并且在SAH的治療過(guò)程中取得了良好的效果［6］，但其作用機(jī)制目前認(rèn)識(shí)尚不明確。因此，本研究引入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬，探討亞低溫與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的關(guān)系，明確亞低溫治療的作用機(jī)制，為其應(yīng)用和推廣提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年清潔級(jí)雄性SD大鼠 （體質(zhì)量350～450 g） 48只，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK （京） 2012-0001。于華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只大鼠隨機(jī)分成4組，分別為假手術(shù)組 （S組，n = 12） 、蛛網(wǎng)膜下腔出血組 （SAH組，n = 12） 、全身亞低溫組（H組，n = 12） 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑組 （TUDCA組，n =12） 。本研究獲得華北理工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器

兔抗Bcclin-1、LC3-Ⅱ一抗，兔抗GRP78、CHOP一抗，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。二抗及其輔助用品，購(gòu)自博奧森生物技術(shù)有限公司。枸櫞酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、DAB顯色試劑盒，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。820-Ⅱ型切片機(jī)，購(gòu)自德國(guó)LEICA公司。TP-1型攤片機(jī)、HP-1型烤箱，購(gòu)自天津天利機(jī)電公司。Olympus攝像顯微鏡、Motic 6.0圖像采集及分析系統(tǒng)、BHS顯微鏡，購(gòu)自日本奧林巴斯公司。電泳儀，購(gòu)自北京東方儀器廠(chǎng)。電轉(zhuǎn)槽，購(gòu)自瑞典Phmarcia公司。

1.3 模型制備及干預(yù)方法

如文獻(xiàn)［7］所述，采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法制備SAH模型。大鼠麻醉后仰臥位，頸正中做切口，逐步分離出頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎、離斷頸外動(dòng)脈，反轉(zhuǎn)180°，使之與頸內(nèi)動(dòng)脈呈一條直線(xiàn)，在頸外動(dòng)脈近心斷端打孔，銳化的4-0聚丙烯紡織纖維縫合線(xiàn)引入到右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，推進(jìn)明顯阻力感后再推3 mm，刺破大腦中動(dòng)脈與大腦前動(dòng)脈分叉處。S組操作同模型組，但不刺破血管。

造模成功判定標(biāo)準(zhǔn)：大體標(biāo)本腦表面散在分布血凝塊；鏡下可見(jiàn)蛛網(wǎng)膜下腔分布大量紅細(xì)胞。

H組于造模成功后即刻向大鼠全身噴灑乙醇配合冰浴行體表降溫，將直腸溫度維持在30～32 ℃4 h；TUDCA組于造模前1 h腹腔注射溶于生理鹽水（100 mg/mL） 的?；切苋パ跄懰?（tauroursodesoxycholic acid，TUDCA，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑） 溶液，再制備SAH模型。

1.4 HE染色

各組取6只大鼠，于造模成功后24 h將大鼠處死，4%多聚甲醛灌注取腦，常規(guī)石蠟包埋，切片 （片厚5 μ m）；梯度乙醇水化，行HE染色，脫水、封片，在光學(xué)顯微鏡 （×400） 下觀(guān)察結(jié)果。每只大鼠海馬CA1區(qū)取6張切片，應(yīng)用Motic 6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)觀(guān)察每組大鼠 （n = 6） 神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化，計(jì)數(shù)單位高倍視野下的存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)并計(jì)算平均值。

1.5 免疫組化

取上述步驟的石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，用高壓抗原修復(fù)2 min，分別滴加GRP78、CHOP、Beclin-1多克隆抗體 （均1∶200稀釋?zhuān)?、LC3-Ⅱ多克隆抗體（1∶300稀釋?zhuān)?在濕盒溫育于4 ℃過(guò)夜；滴加二抗，37℃溫箱30 min，DAB溶液顯色，鏡下觀(guān)察顯色符合要求后，流水終止顯色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片。PBS代替一抗進(jìn)行陰性對(duì)照。每只大鼠每個(gè)因子 （GRP78、CHOP、Beclin-1以及LC3-Ⅱ） 取出3張切片待測(cè)，其中每張切片定位海馬CA1區(qū)，隨機(jī)抽取5個(gè)獨(dú)立視野，在Olympus顯微鏡 （×400） 下觀(guān)察海馬CA1區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，以胞核、胞質(zhì)或胞膜呈淺褐色為入選標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)數(shù)400倍視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算平均值。

1.6 Western blotting

于造模成功后24 h斷頭，冰上取腦，分離海馬，液氮研磨法進(jìn)行總蛋白提取，BCA法測(cè)定海馬區(qū)蛋白濃度，計(jì)算待測(cè)品蛋白濃度的上樣量。測(cè)定每個(gè)因子對(duì)應(yīng)條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照，應(yīng)用Image Lab5.0對(duì)條帶進(jìn)行分析，將目標(biāo)蛋白與GAPDH灰度值的比值作為各因子相對(duì)的表達(dá)量，分析數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用EXCEL軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)比較

S組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)正常，細(xì)胞核大而圓，核膜清楚，核仁明顯。SAH組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞核濃縮、溶解，正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。H組較SAH組胞核濃縮現(xiàn)象減輕，存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。TUDCA組較SAH組神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05） 。見(jiàn)圖1、表1。

2.2 各組GRP78和CHOP蛋白表達(dá)量比較

免疫組化結(jié)果顯示：CHOP蛋白主要表達(dá)于胞質(zhì)，GRP78蛋白主要表達(dá)于胞核，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)中可見(jiàn)大量棕褐色顆粒。與S組相比，SAH組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，H組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，TUDCA組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P ＜ 0.05）。見(jiàn)圖2、表1。

圖1 各組24 h大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化 HE×400Fig.1 Neuronal morphology in the hippocampus of rats in each group after 24 hours HE staining×400

表1 各組SAH大鼠海馬區(qū)存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量及GRP78、CHOP、Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)量的比較Tab.1 Comparison of the number of survival neurons and expression of GRP78，CHOP，Beclin-1，and LC3-Ⅱ in the hippocampus of SAH rats in different groups

Western blotting結(jié)果顯示：與S組相比，SAH組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白表達(dá)水平升高 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，H組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白表達(dá)水平明顯升高 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，TUDCA組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白表達(dá)水平明顯下降 （P ＜0.05）。見(jiàn)圖3、表1。

圖2 各組24 h大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞GRP78和CHOP的表達(dá) 免疫組化染色×400Fig.2 The expression of GRP78 and CHOP proteins in the hippocampal neurons of rats in each group after 24 hours Immunohistochemical staining×400

圖3 各組24 h大鼠海馬GRP78和CHOP蛋白Western blotting檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Western blotting for GRP78 and CHOP proteins in the hippocampus of rats in each group after 24 hours

2.3 各組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量比較

免疫組化結(jié)果顯示：Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)中可見(jiàn)大量棕褐色顆粒。與S組相比，SAH組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，H組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加（P ＜ 0.05）；與SAH組相比，TUDCA組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少 （P ＜ 0.05） 。見(jiàn)圖4、表1。

圖4 各組24 h海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá) 免疫組化染色×400Fig.4 The expression of Beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in the hippocampus of rats in each group after 24 hours Immunohistochemical staining×400

Western blotting結(jié)果顯示：與S組相比，SAH組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，H組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平明顯升高 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，TUDCA組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平明顯下降（P ＜ 0.05） 。見(jiàn)圖5、表1。

3 討論

圖5 各組24 h大鼠海馬Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白Western blotting檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Western blotting for Beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in the hippocampus of rats in each group after 24 hours

本研究結(jié)果顯示，亞低溫干預(yù)后，存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，提示亞低溫干預(yù)對(duì)SAH后神經(jīng)細(xì)胞的死亡可能起到一定的抑制或者延緩作用。研究［8］發(fā)現(xiàn)，低溫的腦保護(hù)作用是通過(guò)降低活性氧自由基、脂質(zhì)過(guò)氧化，降低興奮性谷氨酸活性，從而起到對(duì)腦神經(jīng)的保護(hù)作用。魏紅艷等［9］發(fā)現(xiàn)亞低溫治療可能在一定程度上減輕血管壁的病理?yè)p傷，從而對(duì)維持腦供血、減輕因腦缺血造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷起到改善作用。同時(shí)，亞低溫治療可以通過(guò)減輕血管痙攣，減輕大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而起到腦保護(hù)的作用。本研究結(jié)果與此一致。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，SAH大鼠實(shí)施亞低溫能夠使GRP78、CHOP蛋白表達(dá)增加，提示亞低溫干預(yù)可以進(jìn)一步使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有極強(qiáng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)體系，但受到外界因素如缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、同型半胱氨酸等多種物理、化學(xué)或遺傳因素等作用，均可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［10］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要包括由3個(gè)膜通道蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路，即IREl通路、PERK通路、ATF6 通路，在無(wú)應(yīng)激的狀態(tài)下，上述3個(gè)膜通道蛋白與GRP78蛋白處于緊密結(jié)合狀態(tài)［11］。在受到各種因素刺激下，它們與GRP78發(fā)生分離而被激活，進(jìn)而引發(fā)一系列細(xì)胞因子的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平抑制細(xì)胞凋亡。RANJAN等［12］研究表明CHOP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中扮演重要角色，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)參與腦缺血后的病理生理反應(yīng)，而且CHOP在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起重要作用。CHOP作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的特異轉(zhuǎn)錄因子，在大鼠SAH后，當(dāng)CHOP表達(dá)升高時(shí)，GRP78的表達(dá)會(huì)同樣升高，表明CHOP 可與GRP78同時(shí)表達(dá)作為保護(hù)機(jī)制而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。這與本研究結(jié)果一致。因此，亞低溫的保護(hù)作用可能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激存在一定的關(guān)系。但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是通過(guò)何種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用的，目前尚無(wú)定論。

本研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫干預(yù)后自噬蛋白表達(dá)含量明顯升高，而使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑后自噬蛋白表達(dá)明顯降低；自噬蛋白表達(dá)水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度呈正相關(guān)。這提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與神經(jīng)細(xì)胞自噬存在一定的關(guān)系，可能通過(guò)自噬來(lái)發(fā)揮其保護(hù)作用。自噬是一個(gè)自我分解代謝過(guò)程，通過(guò)溶酶體來(lái)降解細(xì)胞成分［13］。適度自噬的激活可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減少神經(jīng)細(xì)胞的丟失［14］。酵母細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠刺激前自噬體的形成和轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白超過(guò)了蛋白酶體調(diào)節(jié)的降解系統(tǒng)，自噬將被觸發(fā)，以移除這些蛋白［15］。目前學(xué)者［16］認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)自噬的發(fā)生主要依賴(lài)于PERK、ATF6和 IRE-1 增加產(chǎn)生的Ca2+。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞質(zhì)釋放，反過(guò)來(lái)也可激活各種激酶和蛋白酶，可能參與自噬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［17］。HCYERHANSEN等［18］研究結(jié)果證實(shí)Ca2+介導(dǎo)的自噬依賴(lài)于鈣調(diào)蛋白激酶激酶β，活化蛋白激酶，最終抑制roTOR復(fù)合體l而激活自噬。

因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以激活自噬，自噬又可以通過(guò)降解錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)荷，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過(guò)度激活［19］，同時(shí)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物也為機(jī)體細(xì)胞新蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重建以及ATP的生成提供原料，從而減少SAH后早期腦損傷，起到一定的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活神經(jīng)細(xì)胞自噬，可能是亞低溫療法治療的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。