大鼠心肌缺血再灌注實(shí)驗(yàn)技巧的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

黃 婷，李紹旦，楊明會(huì)*，劉 毅

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院，北京 100853)

經(jīng)驗(yàn)交流

大鼠心肌缺血再灌注實(shí)驗(yàn)技巧的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

黃 婷1，2，李紹旦2，楊明會(huì)2*，劉 毅2

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院，北京 100853)

大鼠心肌缺血再灌注造模是一個(gè)極其精細(xì)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，初學(xué)者難免會(huì)遇到阻礙，筆者有幸進(jìn)行了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作，現(xiàn)就本類實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)及遇到的一些挫折進(jìn)行分享。

大鼠；實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)；心肌缺血再灌注

《中國(guó)心血管病報(bào)告2016》指出，心血管病占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，為我國(guó)居民的首位死因。心血管病發(fā)病因素日益增多，已成為重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，防治心血管病刻不容緩[1]。有統(tǒng)計(jì)表明，在現(xiàn)在的醫(yī)學(xué)研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)占有重要的地位。心血管疾病的防治研究中，大鼠缺血再灌注的模型較常見(jiàn)，筆者有幸進(jìn)行了此類實(shí)驗(yàn)，并在其造模過(guò)程中有著長(zhǎng)時(shí)間的摸索。現(xiàn)將自己對(duì)大鼠缺血再灌注實(shí)驗(yàn)技巧的認(rèn)識(shí)簡(jiǎn)單介紹。

1 實(shí)驗(yàn)前的知識(shí)儲(chǔ)備

實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行必要基礎(chǔ)知識(shí)的積累，查閱研究課題相關(guān)文獻(xiàn)，了解實(shí)驗(yàn)大體過(guò)程，確定需要觀察與檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，分層列出表單，如：從三個(gè)層面考慮：組織器官水平檢測(cè)指標(biāo)、細(xì)胞水平檢測(cè)指標(biāo)、分子水平檢測(cè)指標(biāo)等；根據(jù)指標(biāo)查閱相關(guān)檢測(cè)方法，選擇可行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，推測(cè)所需實(shí)驗(yàn)標(biāo)本；依據(jù)實(shí)驗(yàn)所需數(shù)據(jù)，完成初步預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(參考表1、表2)；了解大鼠解剖結(jié)構(gòu)，將大鼠造模步驟熟記于心，進(jìn)行練習(xí)。

表1 預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 數(shù)據(jù)記錄

2 實(shí)驗(yàn)前的技術(shù)準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)涉及大鼠飼養(yǎng)、灌胃、麻醉、造模、取材、檢測(cè)[2]。

一般實(shí)驗(yàn)室大鼠由專門的飼養(yǎng)員來(lái)飼養(yǎng)。

大鼠的灌胃操作包括大鼠的捉拿、固定、灌胃器插入與推注[3]。全程操作注意避免被大鼠抓咬，保證安全。訂購(gòu)?fù)戤叺膶?shí)驗(yàn)大鼠，不可急于灌胃，需要預(yù)適應(yīng)3 d；灌胃過(guò)程保持以柔克剛的理念，忌激惹大鼠，被激惹的大鼠需暫時(shí)放回鼠籠，待其平靜后再操作；若強(qiáng)行灌胃，容易將液體灌入肺或氣管，導(dǎo)致大鼠死亡。灌胃過(guò)程中若遇阻力，可能是插入氣管內(nèi)，應(yīng)立刻退針，停留片刻再操作。在進(jìn)行藥物的推注時(shí)一定要緩慢，特別是粘稠中藥的推注，推注過(guò)快，大鼠容易死亡。很多灌胃液比較粘稠，容易粘在管壁上，需及時(shí)更換灌胃器。為減少大鼠的死亡率，確保實(shí)驗(yàn)可以按時(shí)完成，灌胃的操作練習(xí)，筆者建議隔天練習(xí)半小時(shí)，大約一周時(shí)間熟練運(yùn)用。

大鼠的麻醉一般選用腹腔注射，具體操作參照文獻(xiàn)[4]。麻藥注射量寧少勿過(guò)，麻過(guò)的大鼠造模操作過(guò)程中心肺耐受性降低，死亡率偏高[5]。麻醉效果的評(píng)價(jià)：用指甲掐捏大鼠的四肢趾甲末端，大鼠輕微的抽動(dòng)，若抽動(dòng)較強(qiáng)烈或觀察到大鼠胡須抖動(dòng)有力，則麻醉不足，可以適量補(bǔ)充0.1～0.2 mL麻藥，隔3～5 min觀察效果。

3 心肌缺血再灌注實(shí)驗(yàn)的操作

根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行大鼠心肌缺血再灌注的造模操作，再灌注時(shí)，連接呼吸機(jī)，將活結(jié)第一層解開(kāi)，順著白線方向輕微抖動(dòng)，待出現(xiàn)松動(dòng)感后抽出白線，再灌成功標(biāo)志：缺血部位心肌顏色恢復(fù)，抬高的ST段下降50%以上。

造模過(guò)程注意事項(xiàng)：① 操作時(shí)注意室溫，冬天需在室內(nèi)加用簡(jiǎn)易取暖器，以保持溫度在23℃左右，溫度過(guò)低，大鼠耐受性下降，死亡率則升高。切記，操作時(shí)要輕柔，不可激怒大鼠。② 在呼吸面罩固定后，要使頭頸部保持在一條直線上，輕微牽拉鼠舌，用干凈棉簽擦除口咽分泌物，以免堵塞氣道；開(kāi)胸前，一定保證呼吸機(jī)是正常運(yùn)行模式；筆者在實(shí)驗(yàn)時(shí)偶有發(fā)現(xiàn)呼吸機(jī)接觸不良，呼吸面罩漏氣等，導(dǎo)致后續(xù)操作難以進(jìn)行。此外，開(kāi)胸時(shí)，要盡量采用微創(chuàng)思想，縮小皮膚開(kāi)口，減少組織損傷。③ 剝離心包膜時(shí)，心包膜不可全部剝脫，需保留部分心包膜限制心臟的活動(dòng)，否則心臟跳動(dòng)太劇烈，影響進(jìn)針。④ 在血管結(jié)扎時(shí)盡可能做到精準(zhǔn)，避免回針，較少出血和心臟損傷；切記結(jié)扎前放置5號(hào)白線。血管的結(jié)扎程度以結(jié)扎下部心肌組織顏色變白為標(biāo)志，切記不可結(jié)扎過(guò)緊，以免再灌注時(shí)反復(fù)松解困難，損傷血管。筆者在結(jié)扎血管時(shí)發(fā)現(xiàn)有些大鼠的心臟是右位心，會(huì)出現(xiàn)有些血管纖細(xì)不清，有些血管不規(guī)則等情況，此時(shí)操作更應(yīng)如履薄冰。在胸腔關(guān)閉前注意將胸腔內(nèi)的空氣擠壓或抽離，減少胸腔壓力。胸腔關(guān)閉時(shí)，筆者建議使用符合大鼠胸部曲線的彎止血鉗，夾閉胸腔時(shí)應(yīng)檢查是否漏氣。⑤ 心肌缺血造模完成后，大鼠的擺放應(yīng)注意：觀察其呼吸道是否通暢，頭頸部在一條直線；避免止血鉗懸空，增加胸腔負(fù)擔(dān)。嚴(yán)密觀察大鼠的呼吸情況，及早判斷大鼠的預(yù)后；有些大鼠心肌缺血后，損傷較重，呼吸氣息微弱，胸腔起伏不規(guī)則，死亡率較高。⑥ 再灌后，心臟損傷會(huì)不同程度的加重，筆者建議封閉胸腔后仍呼吸機(jī)維持10～15 min。⑦ 整個(gè)操作過(guò)程熟練掌握，縮短操作時(shí)間，避免血管損傷，減少出血；筆者建議造模大鼠的體重為(300±10) g，其造模成功率較高。

大鼠的取材，一般包括摘取心臟和腹主動(dòng)脈取血。心臟摘取時(shí)，應(yīng)及時(shí)、迅速，避免銳利器械碰觸心肌組織，多余組織的分離需在冰塊上進(jìn)行，以免組織蛋白酶失活。心臟后期的保存一定預(yù)先查閱相關(guān)文獻(xiàn)，免得保存失誤，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。腹主動(dòng)脈的取血，注意在大鼠心臟跳動(dòng)的狀態(tài)下抽血，否則血管干癟，即使抽出血也易凝固堵塞針頭，且離心時(shí)大多會(huì)出現(xiàn)白色絮狀物，導(dǎo)致血清分離不達(dá)標(biāo)；取血時(shí)，手要穩(wěn)，不要著急，避免扎透血管導(dǎo)致大出血，取血失敗。

標(biāo)本的檢測(cè)有定量、定性等，各有不同。筆者僅提醒大家：各檢測(cè)技術(shù)應(yīng)取材前熟知，明確標(biāo)本的保存，如：涉及血清蛋白酶的檢測(cè)時(shí)，需將同一標(biāo)本分裝在多個(gè)凍存管，保存在-80℃，每次檢測(cè)僅取一份，避免反復(fù)解凍，蛋白酶失活。檢測(cè)試劑按照說(shuō)明書保存，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

正式實(shí)驗(yàn)前，務(wù)必進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，查閱相關(guān)文獻(xiàn)及請(qǐng)教專業(yè)老師，調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案，減少反復(fù)實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)研究中，忌急于求成，每個(gè)步驟的操作略粗糙迅速，終前功盡棄；在大鼠開(kāi)胸后，拉鉤器勿傷及肺組織，以免影響呼吸功能，死亡率明顯提高。造模時(shí)，常遇到大鼠心臟左冠狀動(dòng)脈血管不是一支粗血管而是很多細(xì)小的血管分支，此時(shí)建議別選單一的細(xì)小血管結(jié)扎，將整叢血管一起結(jié)扎較容易些，可減少心臟出血的風(fēng)險(xiǎn)。取材時(shí)，若大鼠在造模操作過(guò)程中出血較多，則腹主動(dòng)脈取血時(shí)抽血較少，離心后的血清更少，無(wú)法完成該標(biāo)本相關(guān)檢測(cè)。ELISA法檢測(cè)血清蛋白酶時(shí)，標(biāo)本暴露在外界時(shí)間較長(zhǎng)，酶容易失活，建議使用冰袋控制標(biāo)本周圍的溫度。

心血管疾病的實(shí)驗(yàn)研究可以更好地認(rèn)識(shí)和解釋臨床現(xiàn)象，為溶栓、冠脈搭橋術(shù)和經(jīng)皮冠脈腔內(nèi)成形術(shù)提供最佳方案，輔助藥物預(yù)處理的應(yīng)用[7]。因此筆者總結(jié)了大鼠缺血再灌注模型實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，讓類似實(shí)驗(yàn)的操作者可以減少失誤。因筆者實(shí)驗(yàn)技能及時(shí)間限制，仍存在諸多操作注意事項(xiàng)未摸索，希望同事們能總結(jié)更多操作經(jīng)驗(yàn)以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。

[1] 高曉津, 楊進(jìn)剛, 楊躍進(jìn), 等. 中國(guó)急性心肌梗死患者心血管危險(xiǎn)因素分析 [J]. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2015, 30(3): 206-210.

[2] 侯夢(mèng)夢(mèng), 邢冬梅, 劉璇, 等. 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立的關(guān)鍵性問(wèn)題 [J]. 天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 33(6): 323-326.

[3] 張曉丹. 大鼠灌胃技巧的經(jīng)驗(yàn)總結(jié) [J]. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘, 2016, 16(55): 237.

[4] 童松, 熊南翔, 沈建英. 大鼠腹腔麻醉方法的改進(jìn) [J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué), 2014, 31(1): 52-54.

[5] 李明, 魯衛(wèi)星, 崔現(xiàn)軍, 等. 提高大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型成功率的方法探討 [J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2010, 37(9): 1699-1700.

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[7] 陳路, 李瑋瑋, 劉春慧. 心肌缺血再灌注損傷的中醫(yī)藥研究進(jìn)展及其模型的制備 [J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2015, 35(9): 174-176.

Experienceandskillsintheestablishmentofratmodelofmyocardialischemiaandreperfusion

HUANG Ting1，2， LI Shao-dan2， YANG Ming-hui2 *， LIU Yi2

(1.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China； 2.Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

The establishment of rat model of myocardial ischemia and reperfusion is a very sophisticated experimental process. During animal experiments, beginners always meet with troubles inevitably. The authors of this paper have conducted a great deal of this type of experiments for years, and intend to share some experience and lessons with colleagues.

Rats; Experience and lessons during experiments; Myocardial ischemia and reperfusion

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0080-03

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.09.015

2017-04-04

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(編號(hào)：2012CB518601)。

黃婷(1990-)，女，2015級(jí)在讀碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療老年病。E-mail: 834349733@qq.com

楊明會(huì)(1962-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床。E-mail: ymh9651@sina.com