袋裝臨滄鐵殼麥種子生活力及a-淀粉酶、脂肪氧化酶活性與表達(dá)量分析

周國雁 隆文杰 陳丹 武曉陽 伍少云 蔡青

摘要：【目的】研究鋁箔袋真空密封和尼龍網(wǎng)袋非密封方法包裝貯藏的臨滄鐵殼麥種子生活力指標(biāo)、貯藏期、a-淀粉酶和脂肪氧化酶（LOX）活性及其基因相對表達(dá)量間的關(guān)系，了解其a-淀粉酶和LOX活性及其基因相對表達(dá)量變化影響種子貯藏期的酶學(xué)機(jī)制，為更好地保存臨滄鐵殼麥等云南小麥亞種資源提供參考依據(jù)?！痉椒ā繉⑴R滄鐵殼麥種子真空密封于鋁箔袋和非密封包裝于尼龍網(wǎng)袋內(nèi)，在昆明室內(nèi)溫、濕度條件下貯藏63、125、189、210、252和365 d。采用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)、3，5-二硝基水楊酸、分光光度計(jì)和實(shí)時PCR（RT-PCR）方法，分別測量種子的生活力指標(biāo)、a-淀粉酶和LOX活性及其基因相對表達(dá)量，并進(jìn)行簡單相關(guān)和逐步回歸分析。【結(jié)果】真空密封包裝的種子在貯藏125 d后，發(fā)芽勢為78.3%，發(fā)芽率為96.7%，加權(quán)發(fā)芽指數(shù)為0.622，發(fā)芽指數(shù)為30.933，活力指數(shù)為539.1，而非密封包裝的種子在貯藏125 d后發(fā)芽勢、加權(quán)發(fā)芽指數(shù)及發(fā)芽指數(shù)已明顯下降，至189 d時觀測的5項(xiàng)生活力指標(biāo)均出現(xiàn)斷崖式下降，分別只有125 d時的14.9%～25.0%。兩種方法包裝貯藏后的種子，a-淀粉酶和LOX活性無明顯差異。種子貯藏期與生活力指標(biāo)、酶活性及其基因相對表達(dá)量的簡單相關(guān)及逐步回歸分析結(jié)果表明，在昆明室內(nèi)溫、濕度條件下，非密封方法包裝貯藏的臨滄鐵殼麥種子貯藏期隨加權(quán)發(fā)芽指數(shù)和LOX活性的增加而縮短，隨a-淀粉酶活性和TaLOX3-4A基因相對表達(dá)量的增加而延長，但真空密封方法包裝貯藏的種子，其貯藏期只隨a-淀粉酶基因amy3相對表達(dá)量的減少而延長?！窘Y(jié)論】真空密封在鋁箔袋中的臨滄鐵殼麥種子具有更長的、保持高生活力的貯藏期，其貯藏期不隨a-淀粉酶和LOX活性變化而發(fā)生變化。

關(guān)鍵詞： 真空密封包裝;臨滄鐵殼麥種子;a-淀粉酶;脂肪氧化酶（LOX）;基因相對表達(dá)量;生活力

中圖分類號： S325.1;S512.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）11-2273-09

Analysis of seed viability， a-amylase activity， lipoxygenase activity， and expression levels of Lincang hulled

wheat seed in bags

ZHOU Guo-yan， LONG Wen-jie， CHEN Dan， WU Xiao-yang，

WU Shao-yun*， CAI Qing*

（Biotechnology and Germplasm Resources Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Provincial Key Lab of Agricultural Biotechnology/Key Lab of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Kunming? 650205， China）

Abstract：【Objective】Relationship between vacuum sealed package by aluminium foil bag and non-sealed package by nylon mesh bag in viability index，periods of seed stored（PSS）， activities of a-amylase and lipoxygenase（LOX）and gene relative expression of the Lincang hulled wheat seeds stored in the two packages was studied. Enzymatic mechanism of activities of a-amylase and LOX and gene relative expression affecting PSS was analyzed to provide reference to better store Triticum aestivum ssp. Yunnanense including Lincang hulled wheat. 【Method】Lincang hulled wheat seeds were put into vacuum sealed aluminum foil bag and into? non-sealed nylon mesh bags， stored at indoor temperature and relative humidity conditions in Kunming for 63，125，189，210，252 and 365 d. Then standardized germination test，3，5-dinitrosalicy-lic acid（3，5-DNSA），spectrophotometer and real time PCR（RT-PCR） were used to measure respectively seeds viability index，activities of a-amylase and LOX，and relative expression level（REL） of the seeds.The simple correlation analysis and stepwise regression were also conducted. 【Result】The results showed that the seeds packaged in vacuum sealed method still had very high viability indexes after storing 125 d，whose germination force（GF），germination percent（GP）， weigh-ted germination index（WGI），germination index（GI） and vigor index（VI） were 78.3%，96.7%，0.622，30.933，and 539.1 respectively. But for the seeds after storing 125 d with non-sealed package，GF，WGI and GI had very obvious decline，all the five viability indexes occurred cliff collapse when seeds were stored up to 189 d，only occupied by 14.9%-25.0% of those stored for 125 d.No obvious difference was found in the activities of a-amylase and LOX between seeds packaged by the two methods. The simple correlation and stepwise regression analysis between PSS and seeds viability index，activities of a-amylase and LOX，and REL of genes indicated that，under indoor temperature and relative humidity conditions in Kunming，PSS with non-sealed package way were shortened with increase of WGI and LOX activity，and increased with increase of a-amylase activities and REL of TaLOX3-4A. But PSS with vacuum sealed way was only increased with decrease of REL of a-amylase gene amy3. 【Conclusion】The seeds with vacuum sealed in aluminum foil bag have longer PSS and maintain high viability，because the PSS in this method is not altered with activity changes of a-amylase and LOX.

Key words： vacuum sealed package; Lincang hulled wheat seeds; a-amylase; lipoxygenase（LOX）; relative expression level of genes; viability

0 引言

【研究意義】鐵殼麥?zhǔn)窃颇闲←渷喎N（Triticu-maestivum ssp. yunnanense）資源的俗稱，是云南特有的普通小麥原始栽培類型，具有耐瘠薄、抗旱、抗穗上發(fā)芽及抗條銹病等優(yōu)異特性，在選育抗逆性、綠色、優(yōu)良小麥新品種的研究中具有一定的潛在利用價值。另外，因其具有栽培小麥的野生祖先，如烏拉爾圖小麥、野生二粒小麥和節(jié)節(jié)麥等所特有的穗軸脆弱性（斷穗）和黏殼（包殼）性，也是研究現(xiàn)代栽培六倍體小麥起源與演化的重要工具材料。目前，保存在國家種質(zhì)庫（49份）和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)庫（65份）的鐵殼麥資源，主要采集于20世紀(jì)70—80年代云南的12個縣（市、區(qū)）。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，這種小麥已從原來的種植或分布區(qū)內(nèi)消失。因此，開展鐵殼麥種質(zhì)資源的保存技術(shù)研究并妥善保護(hù)好庫存的種質(zhì)樣品，是保障該珍稀種質(zhì)資源可能被持續(xù)利用的重要課題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有不少關(guān)于不同包裝方法可能影響植物種子貯藏效果的研究報(bào)道。李雪峰等（2009）采用鋁箔袋、鍍鋁袋和紙袋3種方法包裝辣椒種子，在30 ℃恒溫箱中貯藏4個月后，測得鋁箔袋包裝種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別為63.3%和82.0%，而鍍鋁袋和紙袋包裝的種子已完全喪失發(fā)芽能力。田宏等（2011）研究牛皮紙袋和玻璃瓶包裝的扁穗雀麥種子在不同溫度（室溫、4 ℃、-10 ℃）貯藏3、6和12個月后的生活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛皮紙袋包裝貯藏于-10 ℃的種子發(fā)芽率仍在90.0%以上，是保存扁穗雀麥種子的有效方法。李瑞云等（2012）測定了鋁箔袋、銅版紙袋和罐裝貯藏28個月后的黃瓜種子發(fā)芽率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種包裝方法的種子發(fā)芽率存在極顯著差異，其中鋁箔袋包裝的種子發(fā)芽率最高。覃初賢等（2016）通過測定發(fā)芽力、電導(dǎo)率和田間成苗率來評價6種包裝方法貯藏紅麻種子的效果，結(jié)果顯示，與初始發(fā)芽率88.0%相比，紙袋、布袋、薄膜袋和鋁盒包裝的種子在種質(zhì)庫貯藏31年后的發(fā)芽率為79.7%～81.3%，下降明顯;而種子盒和玻璃瓶密封包裝的種子發(fā)芽率仍保持在85.0%以上，是貯藏紅麻種子的有效包裝方法。馮佳強(qiáng)等（2017）研究真空透光和不透光兩種方法包裝貯藏的桔梗種子發(fā)芽勢及發(fā)芽率，結(jié)果顯示貯藏10個月后，真空透光包裝的種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別為22.67%和31.33%，優(yōu)于真空不透光的包裝方法?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】上述前人的研究結(jié)果雖然已表明種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢等生活力指標(biāo)在不同包裝貯藏方法間存在明顯差異，且密封包裝方法貯藏的種子能保持更高的生活力，但目前鮮見在相同貯藏環(huán)境下，密封和非密封包裝貯藏方法通過影響小麥種子的a-淀粉酶和脂肪氧化酶（LOX）活性及其基因相對表達(dá)量，從而影響種子貯藏期限的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以保存的臨滄鐵殼麥為試驗(yàn)材料，研究鋁箔袋真空密封和尼龍網(wǎng)袋非密封包裝方法貯藏的種子生活力指標(biāo)、貯藏期、a-淀粉酶和LOX活性及其基因相對表達(dá)量之間的關(guān)系，了解a-淀粉酶和LOX活性及其基因相對表達(dá)量的變化影響種子貯藏期的酶學(xué)機(jī)制，為更好地保護(hù)臨滄鐵殼麥等云南小麥亞種資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物種質(zhì)庫10年的云南臨滄鐵殼麥（保存編號云0006/XM0927）種子。3，5-二硝基水楊酸、亞油酸、磷酸、檸檬酸、氫氧化鈉、硼酸和醋酸鈉等試劑購于昆明寶賽科技有限公司。主要儀器設(shè)備：DRXM-508C-4型低溫人工氣候箱（寧波江南儀器廠）、DU-730紫外分光光度計(jì)[貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司]、QuantStudio6 Flex RT-PCR儀（美國ABI公司）。

1. 2 種子包裝方法和貯藏處理

2016年1月取出種子，測得出庫發(fā)芽率為91.0%，水含量11.2%。將其中約72 g種子以真空密封方法包裝在6個鋁箔袋（10 cm×15 cm）內(nèi)，每袋約12 g種子，將另外約72 g種子裝在不可密封的尼龍網(wǎng)袋內(nèi)。兩種方法包裝的種子均被置于1—12月月均溫度8.1～19.9 ℃、變幅-5～31 ℃，月均相對濕度72.4%、變幅在58.0%～83.0%及月均降水量11.3～204.0 mm的昆明室內(nèi)貯藏63～365 d。

1. 3 貯藏后種子的生活力指標(biāo)測定

貯藏后的種子發(fā)芽率等生活力指標(biāo)，采用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽方法（GB/T 3543.4—1995）測量。每次測量時，從真空密封方法包裝的鋁箔袋和非密封方法包裝的尼龍網(wǎng)袋內(nèi)分別挑選400粒飽滿的種子，以每100粒為1次重復(fù)，共重復(fù)3次，置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，加淹沒種子厚度一半的無菌水后，于（20±1）℃的人工氣候箱內(nèi)無光培養(yǎng)7 d。自浸泡種子的第2 d起，每天9時開始統(tǒng)計(jì)前一天的發(fā)芽種子數(shù)，并將發(fā)芽的種子挑選至塑料瓶（直徑5 cm、高15 cm）內(nèi)加蓋保濕培養(yǎng)。發(fā)芽試驗(yàn)至第8 d時，每重復(fù)隨機(jī)測量10株幼苗的苗高（芽長+根長，cm），并計(jì)算發(fā)芽勢（GF）、發(fā)芽率（GP）、加權(quán)發(fā)芽指數(shù)（WGI）（Zhang et al.，2014;Barrero et al.，2015）、發(fā)芽指數(shù)（GI）和活力指數(shù)（VI）5個生活力指標(biāo)。

式中，N1、N2、N3…N7為第1、2、3…7 d發(fā)芽的種子數(shù)，Gi為第Di天發(fā)芽的種子數(shù)，S為平均苗高。

試驗(yàn)期一年，計(jì)劃測量6次，每60 d測1次。但在測量貯藏189 d的種子生活力時，發(fā)現(xiàn)尼龍網(wǎng)袋非密封裝的種子發(fā)芽率已大幅下降，而鋁箔袋真空密封裝的種子發(fā)芽率變化不明顯，故補(bǔ)充測量了尼龍袋包裝貯藏210 d的種子生活力指標(biāo)。此外，在檢測貯藏252 d的種子生活力時，發(fā)現(xiàn)非密封包裝的種子大多數(shù)生活力指標(biāo)已明顯下降，個別指標(biāo)如發(fā)芽勢幾乎降至0，故不再繼續(xù)作檢測。

1. 4 α-淀粉酶和LOX溶液的提取與活性評估

1. 4. 1 酶溶液提取 取上述發(fā)芽7 d的種子，吸干表面水分后摘除根芽，稱取1 g置于研缽內(nèi)，加2 mL蒸餾水研磨至勻漿，轉(zhuǎn)至離心管，以4000 r/min離心10 min;取上清液，用蒸餾水標(biāo)定至25 mL，獲得α-淀粉酶原液。另取相同樣品0.5 g放入研缽內(nèi)，加1 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.5），研磨成勻漿，置于4 ℃冰箱冷藏2 h后浸提2 h，12000 r/min離心10 min，獲得LOX溶液60 μL。

1. 4. 2 α-淀粉酶和LOX活性評估

1. 4. 2. 1 α-淀粉酶活性 采用3，5-二硝基水楊酸法測定。在每支試管（其中1支為對照、另外3支為待測）中加入α-淀粉酶原液1 mL，70 ℃水浴15 min，取出用流水迅速冷卻;向每支試管加入pH 5.6的檸檬酸緩沖液1 mL，另外在對照試管中加入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，每支試管均40 ℃水浴15 min，然后分別加入在40 ℃下預(yù)熱的1%淀粉溶液2 mL，搖勻后立即放入40 ℃水浴中保溫5 min，迅速分別加入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL;再從每支試管中取液2 mL轉(zhuǎn)入25 mL試管，分別加入3，5-二硝基水楊酸2 mL，沸水浴5 min;取出冷卻，以蒸餾水稀釋至25 mL，采用紫外分光光度計(jì)測波長520 nm處吸光值。

單獨(dú)配制每次發(fā)芽樣品的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立α-淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)液吸光值（y）與麥芽糖含量（x）的線性回歸方程。然后將實(shí)測樣品3次重復(fù)的吸光值均值與對照吸光值均值的差值（DA）代入方程，折算出麥芽糖含量，再由麥芽糖含量求得α-淀粉酶活性。本研究計(jì)算樣品麥芽糖含量的線性回歸方程如下：

y1=-0.021+0.265x（R2=0.995，P=0.006<0.01）

y2=-0.032+0.306x（R2=0.987，P=0.000<0.01）

y3=-0.021+0.283x（R2=0.997，P=0.000<0.01）

y4=-0.025+0.288x（R2=0.995，P=0.000<0.01）

y5=-0.027+0.276x（R2=0.994，P=0.007<0.01）

y6=-0.035+0.290x（R2=0.991，P=0.000<0.01）

式中，y1、y2、[y]3…y6分別為貯藏63、125、189、210、252和365 d后的樣品吸光值，x的變化能解釋98%以上的y變化（R2=0.987～0.995）。所以，由這些方程估算出的麥芽糖含量的可靠性均在98%以上。

1單位的α-淀粉酶活性為每克樣品在孵化5 min后產(chǎn)生1 mg的麥芽糖含量。樣品的α-淀粉酶活力（mg/g）=利用上述回歸方程求得的麥芽糖含量（mg）×淀粉酶原溶液總體積（mL）/[樣品重（g）×5 min×顯色用酶液體積（mL）]。

1. 4. 2. 2 LOX活性 采用分光光度法度量。亞油酸底物為0.5 mL吐溫20溶解于10 mL 0.05 mol/L硼酸緩沖液（pH 9.0）中，混勻，再逐滴加入0.5 mL亞油酸。混勻后，加入1.3 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液澄清，再加入90 mL 0.05 mol/L硼酸緩沖液（pH 9.0），用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.0后定容至200 mL。反應(yīng)體系為在4.75 mL 0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 5.6）中加入0.15 mL亞油酸底物和30 μL酶溶液。最后用分光光度計(jì)讀取波長234 nm處吸光值。

1單位的LOX活性為在反應(yīng)總體系中LOX在波長234 nm處1 min產(chǎn)生1光密度（Surrey，1964）。

1. 5 α-淀粉酶和LOX基因相對表達(dá)量的實(shí)時定量PCR檢測

1. 5. 1 RNA提取、cDNA合成及其PCR擴(kuò)增 取在上述發(fā)芽試驗(yàn)中生長7 d的幼苗葉片，按照寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的試劑盒（TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit）及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTm ?? 1st Strand cDNA Synthesis Kit）使用指南，提取和檢測RNA，合成并保存cDNA于 -20 ℃冰箱備用。采用該公司的生物試劑盒[SYBR? Premix Ex TaqTM（TIiRNaseH Plus）]進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。反應(yīng)體系20.0 ?L： SYBR? Premix Ex Taq（TIiRNaseH Plus）（2×）10.0 ?L、PCR Forward Primer（10 ?mol/L）0.4 ?L、PCR Reverse Primer（10 ?mol/L）0.4 ?L、ROX Reference Dye ??（50×）0.4 ?L、DNA模板2.0 ?L、ddH2O 6.8 ?L。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，進(jìn)行40個循環(huán)。

1. 5. 2 擴(kuò)增臨滄鐵殼麥cDNA的PCR引物 擴(kuò)增臨滄鐵殼麥cDNA的引物（表1）為小麥α-淀粉酶基因（amy1、amy3）（周飛，2011;Yang et al.，2014）及其內(nèi)參基因（actin-wheat）引物（Niu et al.，2005），小麥LOX基因（TaLOX2-5DL、TaLOX3-4A）及其內(nèi)參基因（26S rRNA）引物（Feng et al.，2012），由昆明森格瑪生物科技有限公司合成。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

利用IBM SPSS statistics 19單因素方差、雙變量簡單相關(guān)及逐步回歸分析法分析獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，基因相對表達(dá)量以[2-△Ct]（Li et al.，2017）表示，表示的相對表達(dá)量并被用于對生活力指標(biāo)、貯藏期等計(jì)算簡單相關(guān)系數(shù)和作為自變量參與對貯藏期的逐步回歸分析。式中，△Ct=樣品目標(biāo)基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同包裝方法對臨滄鐵殼麥種子生活力的影響

在昆明室內(nèi)溫、濕度環(huán)境條件下，以真空密封和非密封兩種方法包裝貯藏63～365 d的臨滄鐵殼麥種子的加權(quán)發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)5項(xiàng)生活力指標(biāo)隨貯藏期變化的趨勢明顯不同（圖1）。真空密封（鋁箔袋）包裝種子的生活力指標(biāo)在前4個貯藏期（63、125、189和252 d）中均無明顯差異，貯藏至365 d時才明顯下降。相反，非密封（尼網(wǎng)龍袋）包裝的種子，在貯藏125 d后的加權(quán)發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢及貯藏189 d后的發(fā)芽率和活力指數(shù)均明顯下降，貯藏期至189 d時，加權(quán)發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)分別僅為125 d時的21.1%、19.5%、25.0%、14.9%和16.8%，呈現(xiàn)出斷崖式驟降。

圖1顯示，在相同貯藏期內(nèi)，真空密封和非密封包裝的種子在貯藏63 d后加權(quán)發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽率已存在顯著差異（P<0.05，下同），真空密封包裝的種子加權(quán)發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽率分別為0.638和92.3%，顯著高于非密封包裝種子（0.576和85.3%）;在貯藏125 d后，兩種方法包裝的種子發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢和活力指數(shù)間也存在顯著差異，且同樣表現(xiàn)為真空密封包裝的種子（30.933、78.3%、539.1）顯著高于非密封包裝的種子（22.433、28.0%、375.5）。貯藏至252 d時，非密封包裝種子的5項(xiàng)生活力指標(biāo)觀測值均很小且接近于0，具體為加權(quán)發(fā)芽指數(shù)0.038、發(fā)芽指數(shù)1.832、發(fā)芽勢2.3%、發(fā)芽率7.7%和活力指數(shù)7.1;但真空密封包裝的種子仍保持較高的生活力，加權(quán)發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)依次為0.654、33.533、86.0%、91.0%和500.0，與貯藏125 d相比，差異不明顯?？梢姡婵彰芊獍b方法能使種子保持較高的生活力。

2. 2 兩種包裝方法對臨滄鐵殼麥種子a-淀粉酶和LOX活性的影響

真空密封包裝和非密封包裝貯藏臨滄鐵殼麥種子的a-淀粉酶（圖2-A）和LOX（圖2-B）活性變化趨勢一致，隨著貯藏時間的延長，a-淀粉酶活性表現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢，LOX活性表現(xiàn)先下降后上升再下降的變化趨勢。兩種方法包裝種子的a-淀粉酶活性在4個貯藏期之間均無顯著差異（P>0.05，下同），其中非密封包裝種子的a-淀粉酶活性在4個貯藏期分別為5.5、3.4、2.1和7.1 mg/g，真空密封包裝種子分別為4.8、4.5、2.3和6.5 mg/g。真空密封包裝種子的LOX活性在貯藏至63和189 d（3.2和3.7 mg/g）時顯著高于相應(yīng)貯藏期的非密封包裝種子（2.7和3.2 mg/g），其他貯藏期之間的LOX活性則無顯著差異。

2. 3 兩種包裝方法貯藏的臨滄鐵殼麥種子貯藏期與生活力指標(biāo)、酶活性及基因相對表達(dá)量的關(guān)系

2. 3. 1 簡單相關(guān)分析結(jié)果 簡單相關(guān)分析結(jié)果（表2）表明，非密封包裝種子的貯藏期與5項(xiàng)生活力指標(biāo)均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01，下同），與amy3基因相對表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，與a-淀粉酶活性、LOX活性及amy1、TaLOX2-5DL和TaLOX3-4A基因相對表達(dá)量則無顯著相關(guān)性，說明非密封包裝種子的貯藏期主要受生活力指標(biāo)及amy3基因相對表達(dá)量影響，并隨生活力指標(biāo)及amy3基因相對表達(dá)量的增加而變短。真空密封包裝種子的貯藏期與發(fā)芽率和活力指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，與amy3、TaLOX2-5DL和TaLOX3-4A基因相對表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與加權(quán)發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢、a-淀粉酶和LOX活性及amy1基因相對表達(dá)量的相關(guān)性則不明顯，說明真空密封方法包裝的種子貯藏期主要受生活力指標(biāo)的發(fā)芽率和活力指數(shù)及LOX基因相對表達(dá)量影響，并隨兩個生活力指標(biāo)及3個基因相對表達(dá)量的增加而變短。

2. 3. 2 逐步回歸分析結(jié)果 以種子貯藏期為因變量（y），生活力指標(biāo)、酶活性及其基因相對表達(dá)量為自變量（x）進(jìn)行逐步回歸分析（表3），得到非密封包裝貯藏的種子貯藏期回歸方程y=174.587-291.544x1（加權(quán)發(fā)芽指數(shù)）-9.034x7（LOX活性）+5.633x6（a-淀粉酶活性）+4779.117x11（TaLOX3-4A基因相對表達(dá)量）。該方程的F=354.987，Sig.=0.000，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，決定系數(shù)R2=0.994，調(diào)整后R2=0.992，說明非密封包裝貯藏種子的加權(quán)發(fā)芽指數(shù)、a-淀粉酶活性、LOX活性和TaLOX3-4A基因相對表達(dá)量對種子貯藏期有明顯影響。這些指標(biāo)的變化能解釋貯藏期99%的變化。因此，非密封方法包裝貯藏的種子貯藏期主要依賴于這4個自變量的變化而變化，與簡單相關(guān)系數(shù)分析揭示的生物學(xué)信息不同。此外，該方程的常量及自變量的回歸系數(shù)均達(dá)到0.05顯著水平，說明方程的擬合性非常好。根據(jù)4個指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)，即對貯藏期的直接真實(shí)貢獻(xiàn)率（通徑系數(shù)），可看出種子的貯藏期與加權(quán)發(fā)芽指數(shù)的簡單相關(guān)性是真實(shí)的（r=-0.966，標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)-0.973，兩者相當(dāng)），而與a-淀粉酶、LOX活性及TaLOX3-4A基因相對表達(dá)量的相關(guān)性被夸大或縮小。其中，種子貯藏期與a-淀粉酶和LOX活性的相關(guān)系數(shù)分別被夸大了2.0倍和約1.4倍，與TaLOX3-4A基因相對表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)則被縮小了46.0倍。

真空密封方法包裝貯藏的種子貯藏期回歸方程為y=328.127-43.031x9（amy3基因相對表達(dá)量）。方程的F=16.003，Sig.=0.002，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但R2及調(diào)整后的R2分別為0.552和0.518，說明amy3基因相對表達(dá)量變化只能解釋種子貯藏期約50%的變化。種子貯藏期與amy3基因相對表達(dá)量的相關(guān)性（r=-0.770）和標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)（-0.743）相當(dāng)，說明amy3基因相對表達(dá)量對種子貯藏期的影響同樣真實(shí)可靠。

因此，與非密封包裝方法相比，真空密封包裝方法貯藏的種子貯藏期變化與生活力指標(biāo)、a-淀粉酶和LOX活性的變化無關(guān)，即在昆明室內(nèi)溫、濕度環(huán)境下，真空密封包裝方法限制了加權(quán)發(fā)芽指數(shù)、a-淀粉酶和LOX活性對種子貯藏期的直接影響，比非密封包裝方法有更長的使種子保持高生活力的貯藏期。

3 討論

種子貯藏環(huán)境中的溫、濕度及種子自身水含量等因素單獨(dú)或綜合影響著種子的生活力（Niane et al.，2013;辛霞等，2013;Petrenko，2014）和平衡水分。在一定溫度和濕度條件下，種子自身水含量（初始水含量）會與其貯藏環(huán)境中的相對濕度發(fā)生互動，謀求水分平衡，也就是種子發(fā)生吸濕與解吸濕現(xiàn)象的過程。相同的種子在不同初始水含量、貯藏溫度和相對濕度條件下的吸濕與解吸濕過程不同。已有研究表明，尼龍網(wǎng)袋（非密封）包裝的初始水含量為8.0%的小麥種子貯藏在溫度15、25、40 ℃和相對濕度≤18.8%，初始水含量為13.5%貯藏在15 ℃和相對濕度<48.1%，初始水含量為13.5%貯藏在25、40 ℃和相對濕度<18.8%，初始水含量為18.0%貯藏在溫度15、25、40 ℃和相對濕度≤48.1%的環(huán)境下是解吸濕變化，在其他條件下則是吸濕變化（王婧等，2011）。在本研究中，貯藏臨滄鐵殼麥種子的溫、濕度條件為年均最高氣溫20.8 ℃、最低氣溫10.3 ℃、變幅在-5～31 ℃范圍內(nèi)，降水總量1011.3 mm;歷年（1971—2000年共30年）1—12月月均溫度8.1～19.9 ℃，月均降水量11.3～204.0 mm，月均相對濕度72.4%，變幅在58.0%～83.0%的昆明室內(nèi)環(huán)境。因此，尼龍網(wǎng)袋非密封包裝貯藏在這種環(huán)境下的臨滄鐵殼麥種子（初始水含量11.2%）應(yīng)呈吸濕變化，這種推測在貯藏試驗(yàn)結(jié)束后對剩余種子水含量的測定結(jié)果中得到證實(shí)。因?yàn)榉敲芊獍b的臨滄鐵殼麥種子在貯藏試驗(yàn)結(jié)束后的水含量為14.7%，較初始水含量增加了3.5%，而真空密封包裝種子的水含量保持在11.5%左右，與初始水含量相當(dāng)。

非密封方法包裝貯藏的臨滄鐵殼麥種子在貯藏過程中為吸濕變化，加速呼吸和老化，消耗胚萌發(fā)需要的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致種子生活力迅速下降直至死亡，故在貯藏125 d后，其加權(quán)發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)及發(fā)芽勢均出現(xiàn)明顯下降，分別只有貯藏63 d時的70.0%、76.0%和48.3%;且在貯藏189 d后，5項(xiàng)生活力指標(biāo)也都出現(xiàn)斷崖式減少。而真空密封方法包裝的種子，由于鋁箔袋阻擋了種子與濕空氣直接接觸，減輕了種子水含量隨空氣相對濕度變化的程度，并限制袋內(nèi)氧離子活動，延緩種子脂肪的氧化速率和衰老，故在貯藏125和189 d后仍保持著較高的生活力水平，其加權(quán)發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)依次為0.622和0.634、30.933和32.967、78.3%和79.7%、96.7%和92.3%、539.1和548.0，分別是非密封包裝貯藏相同時間種子的1.5和7.5、1.4和7.5、2.8和11.3、1.1和7.5、1.4和8.7倍。

在任意貯藏期內(nèi)，真空密封方法包裝種子的5項(xiàng)生活力指標(biāo)均高于非密封包裝，但其a-淀粉酶和LOX活性并非都高于非密封包裝的種子。因此，貯藏后臨滄鐵殼麥種子的α-淀粉酶活性隨種子生活力指標(biāo)變化趨勢與雜交稻種子的α-淀粉酶活性變化隨種子活力的變化趨勢一致（林程等，2017）不同。雖然真空密封和非密封方法包裝貯藏臨滄鐵殼麥種子的a-淀粉酶、LOX活性與5項(xiàng)生活力指標(biāo)的相關(guān)性不明顯（相關(guān)系數(shù)為-0.044～0.230和-0.081～0.234、 -0.304～-0.469和-0.300～0.414），但逐步回歸分析結(jié)果表明，非密封方法包裝種子的貯藏期隨加權(quán)發(fā)芽指數(shù)、a-淀粉酶和LOX活性、TaLOX3-4A基因相對表達(dá)量的變化而變化，這4個因素的變化能解釋種子貯藏期變異的99%。LOX基因TaLOX3-4A的相對表達(dá)量能延長種子的貯藏期，與Long等（2013）在水稻中觀測到的LOX基因sLOX3過量表達(dá)對種子壽命有負(fù)影響的結(jié)果不一致，原因有待進(jìn)一步探究。在真空密封方法包裝的種子中，種子貯藏期只與a-淀粉酶基因amy3的相對表達(dá)量有密切關(guān)系，回歸系數(shù)為-43.031，說明amy3基因相對表達(dá)量越高，種子的貯藏期越短，而加權(quán)發(fā)芽指數(shù)、a-淀粉酶和LOX活性沒有或很少影響種子的貯藏期，也就是說鋁箔袋真空密封方法包裝的種子，其貯藏期的變化與生活力指標(biāo)及a-淀粉酶和LOX活性變化無明顯關(guān)聯(lián)。

已有研究表明，溫度能明顯改變種子的a-淀粉酶（Biddulph et al.，2008;萬中原等，2013;劉美等，2014）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）（Biddulph et al.，2008;廖樂等，2015）、LOX（Tamás et al.，2009;Kosakivska et al.，2014;張福彥等，2016）的活性及其基因相對表達(dá)量，而酶活性的改變，尤其是LOX，又能明顯影響種子的生活力（Long et al.，2013;Dong et al.，2015）。本研究結(jié)果表明，在相同溫度條件下，不同包裝方法可能引起種子的水含量變化，并導(dǎo)致種子的a-淀粉酶、LOX活性及其基因相對表達(dá)量發(fā)生變化，而這兩種酶的活性及表達(dá)量變化又強(qiáng)烈地影響著種子的貯藏期變化。

4 結(jié)論

在昆明室內(nèi)溫、濕度條件下，鋁箔袋真空密封包裝貯藏的臨滄鐵殼麥種子較尼龍網(wǎng)袋非密封包裝的種子有更高的生活力和更長的貯藏期，是因?yàn)檎婵彰芊獍b方法改變了種子貯藏期依賴于a-淀粉酶和LOX活性變化的關(guān)系，從而降低了a-淀粉酶和LOX活性對種子貯藏期的直接影響。

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