樟葉越桔1株內(nèi)生真菌的鑒定及其抑菌活性

陳肖學(xué) 樊苗苗 張 訸 羅旭璐 趙長林 伍建榕 李 靖 趙 平

(1. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

植物內(nèi)生真菌是指在其生活史中的一定階段或全部階段生活在健康植物的組織和器官內(nèi)，對(duì)植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌，包括在其生活史中的某一階段營表面生活的腐生菌、對(duì)宿主暫時(shí)沒有傷害的潛伏性病原菌和菌根菌[1]。自1993年Stierle等[2]從短葉紅豆杉 (Taxusbrevifolia) 中分離得到1株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌 (Taxomycesandreanae) 以來，植物內(nèi)生真菌及其活性產(chǎn)物一直是植物學(xué)研究領(lǐng)域的主要熱點(diǎn)之一。大量研究發(fā)現(xiàn)，許多內(nèi)生真菌在與宿主植物共生的過程中，能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)植物生長發(fā)育、抗逆抗病等具有重要作用。同時(shí)，從宿主植物中分離出來的內(nèi)生真菌也會(huì)產(chǎn)生與植物成分明顯不同的代謝產(chǎn)物，某些代謝產(chǎn)物還具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景[3-6]。利用生物來源產(chǎn)物開發(fā)農(nóng)用藥劑并作為合成農(nóng)藥的替代品，植物內(nèi)生真菌是具有廣闊前景的微生物資源，如從內(nèi)生真菌代謝物中分離制得的各種生物殺菌劑包括生物堿、萜類、類固醇、異香豆素、色素、酚類和揮發(fā)物等對(duì)植物病原真菌顯示出較好的抑制活性[7]。

杜鵑花科 (Ericaceae) 越桔屬植物樟葉越桔 (Vacciniumdunalianum)，主要分布于中國西南、緬甸、越南等地，全株藥用，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)的功效[8]，在云南彝族民間常將其幼嫩葉芽加工制成茶代用品一直飲用至今[9]。Zhao等[10]發(fā)現(xiàn)該植物富含熊果苷類衍生物，并推測(cè)其高含量的蓄積不僅與樟葉越桔本身的遺傳、生境等密切相關(guān)，還很可能是植株內(nèi)生菌微生態(tài)系統(tǒng)與宿主互作所產(chǎn)生的結(jié)果。迄今為止，國內(nèi)外對(duì)樟葉越桔內(nèi)生真菌的研究尚未見報(bào)道，對(duì)越桔屬植物內(nèi)生真菌的研究則多集中于菌群多樣性、菌根菌等[11-18]。本研究從云南省野生樟葉越桔葉中分離得到1株內(nèi)生真菌VDL117，采用形態(tài)學(xué)分類方法、rDNA和ITS序列的測(cè)定以及系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，測(cè)定了其發(fā)酵液對(duì)棉花枯萎菌 (Fusariumoxysporiumsp.vasinfectum) 等5種常見農(nóng)作物病原真菌的抑菌活性，并對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行了酸堿穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，以期為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1植物材料

供試樟葉越桔樣品于2016年10月采自云南省武定縣，挑選生長良好的植株隨機(jī)采摘健康的葉片供內(nèi)生真菌分離用。

1.1.2供試植物病原真菌

棉花枯萎菌 (Fusariumoxysporiumsp.vasinfectum)、辣椒鐮刀菌 (F.solani)、黃瓜枯萎菌 (F.ox-

ysporiumsp.cucumebrium)、水稻稻瘟菌 (Magnapor-

thegrisea)、白菜黑斑菌 (Alternariabrassicae)，由西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.3培養(yǎng)基

馬鈴薯蔗糖瓊脂 (PSA) 培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌分離及純化，液體馬鈴薯蔗糖 (PSB) 培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌發(fā)酵。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離

用自來水將樟葉越桔新鮮葉片洗凈，再用蒸餾水沖洗晾干水分后，用75%乙醇浸泡45 s，再用0.1%升汞浸泡3 min，最后用無菌水清洗3遍。用組織塊印跡法檢驗(yàn)表面消毒是否徹底，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，觀察對(duì)照皿是否有菌生長，無菌生長即證明表面消毒徹底。將消毒處理后的葉片切成0.5 cm × 0.5 cm的小塊接種于PSA培養(yǎng)基內(nèi)，置于28 ℃條件下避光靜置培養(yǎng)1周左右，期間隨時(shí)觀察，待葉片邊緣長出菌絲，挑取菌絲前端接入新的PSA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)純化培養(yǎng)3～4代得到單一菌株。

1.2.2內(nèi)生真菌的鑒定

1) 形態(tài)鑒別。將純化后的菌株VDL117接種到PSA平板上，28 ℃條件下培養(yǎng)，觀察菌絲和菌落的形態(tài)、大小、顏色等特征，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體及孢子形態(tài)。

2) 分子生物學(xué)鑒定。參照Omegabiotek公司高純真菌DNA提取試劑盒D3195HP Fungal DNA Kit方法，提取菌株VDL117的DNA。用真菌通用引物ITS1 (5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′)、ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：DNA模板4.0 μL，dd H2O 6.5 μL，ITS1 1.0 μL，ITS4 1.0 μL，2 × Taq PCR mater Mix 12.5 μL。PCR循環(huán)體系：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，51.5 ℃退火30 s，70 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；70 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序獲得的序列與GenBank (http://www.ncbi.nem.nih.gov) 上登錄的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)，將相關(guān)序列在軟件Clustal X1.83上進(jìn)行多序列比對(duì)后，用軟件PAUP 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3VDL117液體發(fā)酵

用5 mm打孔器在已培養(yǎng)7 d的VDL117菌落邊緣切取圓形菌餅，接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7～10 d。采用抽濾裝置過濾，發(fā)酵液用0.22 μm濾膜過濾后，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4抑菌活性測(cè)試

采用生長速率法[19]測(cè)定VDL117發(fā)酵液對(duì)5種植物病原真菌的抑菌活性，發(fā)酵液與培養(yǎng)基按體積比3∶7的比例混勻后倒平板，并接入5 mm直徑的病原真菌菌餅，28 ℃暗培養(yǎng)3 d后按公式計(jì)算抑菌率。抑菌率=(對(duì)照組供試菌凈生長半徑-處理組供試菌凈生長半徑)/對(duì)照組供試菌凈生長半徑 × 100%。

1.2.5VDL117發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性測(cè)定

1) 酸堿穩(wěn)定性。參考張艷軍[20]的方法，將菌株發(fā)酵液分別用HCl和NaOH調(diào)整pH為2、4、6、8、10，靜置24 h后，同樣采用生長速率法，取3 mL加入到7 mL PSA培養(yǎng)基中，以白菜黑斑病菌為指示菌，以不加發(fā)酵液的平板為空白對(duì)照，以加入3 mL未作處理發(fā)酵液的平板為條件對(duì)照， 28 ℃暗培養(yǎng)3～5 d，測(cè)量直徑后按上式計(jì)算抑菌率。

2) 熱穩(wěn)定性。將菌株發(fā)酵液分別在60、70、80、90、100 ℃條件下處理40 min，冷卻后取3 mL加入到7 mL PSA培養(yǎng)基中，每個(gè)處理重復(fù)3次，同樣以白菜黑斑病菌為指示菌，按上述操作處理后按上式計(jì)算抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株VDL117的鑒定

觀察菌株VDL117的形態(tài)為：菌落不平，稍厚，中央部分隆起或凹陷，顏色差異大，初為白色，后呈不同程度的綠色，有輻射狀溝紋；菌絲體呈黃褐色或紅肉桂色，分生孢子頭較小，初為球形，后呈輻射形，頂囊半球形、稍長形或呈橢圓形。菌落、菌絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)見圖1。參考 《中國真菌志》[21]，上述形態(tài)特征與雜色曲霉 (Aspergillusversicolor) 基本一致。

圖1 菌株VDL117Fig.1 Grown status of strain VDL117

在NCBI中采用BLAST對(duì)VDL117 ITS序列進(jìn)行比對(duì)，VDL117與雜色曲霉 (GenBank登錄號(hào)為LN898740[22])，相似度為100%，E值為0.0。其他用于同源性分析的序列分別是：溫特曲霉 (A.wentii) (KX419438, KY859371)，具黃曲霉 (A.aureolatus) (KR261445, KR261454[23])，彎頭曲霉 (A.deflectus) (FJ531159, KF032649[24])，榛曲霉 (A.clavatus) (EF151929[25], KP749943[26])，黃曲霉 (A.flavus) (HQ844705[27], KC621105)，煙曲霉 (A.fumigates) (JN112377[28], KT162917[29])，多色曲霉 (A.multicolor) (NR_135360, KM979502)，外源序列選擇與雜色曲霉同科不同屬的鏈孢粘帚霉 (Gliocladiumcatenulatum) (AF008923[30])。基于rDNA-ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，菌株VDL117與A.versicolor(LN898740) 聚為一支，自展值為99%。結(jié)合上述形態(tài)特征及分子鑒定結(jié)果，菌株VDL117鑒定為曲霉屬雜色曲霉。

2.2 內(nèi)生真菌VDL117對(duì)病原真菌的抑菌活性

在本實(shí)驗(yàn)中，為得知菌株VDL117發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性，故未將發(fā)酵液減壓濃縮，而直接用發(fā)酵液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，菌株VDL117發(fā)酵液對(duì)5種病原真菌的生長均具有不同程度的抑制作用。從病原菌接入帶發(fā)酵液的平板后生長第4天起測(cè)量其生長直徑并計(jì)算抑制率，結(jié)果如表1所示。其中，發(fā)酵液對(duì)棉花枯萎病菌、辣椒鐮刀菌、白菜黑斑病菌、黃瓜枯萎病菌和水稻稻瘟病菌的最大抑制率分別為27.49%、23.26%、18.27%、13.98%和13.04%。對(duì)于不同的病原真菌，最大抑制率出現(xiàn)的時(shí)間各有不同，但從5 d開始，發(fā)酵液對(duì)5種病原真菌的抑制率均有不同程度的下降。

圖2 基于內(nèi)生真菌VDL117 rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the rDNA-ITS sequence of endophytic fungi VDL117

表1 菌株VDL117對(duì)5種病原真菌生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of strain VDL117 on the growth of 5 pathogenic fungus

病原真菌4dD/mmIR/%5dD/mmIR/%6dD/mmIR/%7dD/mmIR/%棉花枯萎病菌35.17±0.8527.49*44.33±0.9417.9055.00±1.4116.6766.00±1.4115.38辣椒鐮刀菌36.83±1.1823.26*46.67±0.9422.2260.50±1.4720.3966.17±1.0317.29黃瓜枯萎病菌31.50±0.4113.7040.00±0.0013.98*51.33±0.4712.2561.17±0.2411.35水稻稻瘟病菌40.00±0.0013.04*49.75±0.2512.7261.00±0.0010.9569.75±0.759.42白菜黑斑病菌34.00±1.476.8542.50±1.8718.27*52.50±1.8716.6763.33±1.7012.64

注：D為病原真菌菌落生長平均凈直徑；IR為VDL117發(fā)酵液對(duì)病原真菌的抑制率；*為最大抑制率。

2.3 VDL117發(fā)酵液對(duì)白菜黑斑病菌的抑制作用

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，溫度和pH值變化會(huì)影響VDL117發(fā)酵液的抗菌活性。以白菜黑斑病菌為指示菌，選擇病原菌接入帶毒平板后生長第5天的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如表2所示。

VDL117發(fā)酵液的初始pH值為5～6，當(dāng)pH調(diào)至2和4時(shí)，其對(duì)白菜黑斑病菌的抑制作用顯著增加，pH達(dá)到2時(shí)，抑制作用達(dá)到最大值30%；當(dāng)pH調(diào)至6以上時(shí)，其抑制作用開始下降，pH達(dá)到10時(shí)，抑制作用降低至0%。在添加了3 mL pH值為2，4，6，8，10的無菌水的對(duì)照皿中，病原真菌的生長未受到顯著影響。由此可知，在堿性條件下，菌株VDL117發(fā)酵液的抗菌活性會(huì)降低甚至喪失，而酸性條件能增強(qiáng)其抗菌活性。60～70 ℃發(fā)酵液的抗菌活性變化較小，幾乎不受影響。當(dāng)溫度超過70 ℃，發(fā)酵液對(duì)白菜黑斑病菌的抑制作用開始下降，但當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時(shí)，其抑制作用又有所上升，推測(cè)可能是在這一溫度下發(fā)酵液成分發(fā)生了變化，形成了某些具抑菌活性的物質(zhì)所致。當(dāng)溫度繼續(xù)升高至121 ℃時(shí)，發(fā)酵液活性又有所下降。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在制備菌株VDL117的抑菌活性產(chǎn)物時(shí)應(yīng)避免堿性環(huán)境，并將溫度保持70 ℃以下。

表2 不同條件處理下VDL117發(fā)酵液對(duì)白菜黑斑病菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of VDL117 fermentation broth on A.bressicae under different treatments

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)樟葉越桔內(nèi)生真菌VDL117進(jìn)行了形態(tài)鑒定和分子鑒定，將其歸屬為曲霉屬雜色曲霉，采用生長速率法測(cè)定了其對(duì)5種植物病原真菌的生長抑制作用，結(jié)果表明內(nèi)生真菌VDL117有較好的抑菌活性，其發(fā)酵液在酸性條件下對(duì)白菜黑斑病菌的抑制活性較強(qiáng)，堿性條件下活性減弱，并在70 ℃及以下溫度能保持活性穩(wěn)定。據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，曲霉屬真菌次生代謝產(chǎn)物是天然活性先導(dǎo)化合物的主要來源之一，很多產(chǎn)物不僅具有新穎獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，而且具有抗菌、抗癌、抗腫瘤、殺蟲和除草等多種生物活性[31-32]。羅寒等[33]從分離自紅樹林植物欖李新鮮葉片中內(nèi)生真菌雜色曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到22-epi-aflaquinolone B、4個(gè)4-苯基-3,4-二氫喹啉酮類化合物和4個(gè)喹諾唑啉酮類化合物，這些化合物均表現(xiàn)出較好的抗菌活性；吳亞騰等[34]發(fā)現(xiàn)大葉山楝中雜色曲霉的菌絲體物質(zhì)對(duì)4種真菌有較好拮抗作用；伊艷杰等[35]從小麥莖葉組織中分離得到的雜色曲霉對(duì)禾谷絲核菌 (Rhizoctoniacerealis) 有明顯抑制效果；董世豪等[36]從相似蜂海綿內(nèi)生真菌雜色曲霉中分離得到6個(gè)化合物，其中化合物土曲霉酮具有體外抗炎活性，表明不同來源雜色曲霉的抑菌活性較為明顯，值得進(jìn)一步深入研究和開發(fā)利用。

生物防治是解決化學(xué)農(nóng)藥負(fù)效應(yīng)的理想有效途徑之一，生物活性物質(zhì)在生產(chǎn)加工過程中，能否有效保持和發(fā)揮作用，易受環(huán)境及自身穩(wěn)定性影響[37]，篩選得到的具良好抑菌效果的菌株，應(yīng)檢測(cè)其抑菌穩(wěn)定性，從而最大程度發(fā)揮其生防潛力。在本研究中，樟葉越桔內(nèi)生真菌雜色曲霉表現(xiàn)出對(duì)5種常見農(nóng)作物病原真菌的較好抑制活性，并了解了其發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性，為樟葉越桔雜色曲霉活性代謝產(chǎn)物的分離制備提供了參考。但要充分發(fā)揮該菌株的生防潛力，了解其致毒性、致毒機(jī)理以及與宿主的互作關(guān)系等，還需在菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化、代謝產(chǎn)物分離、抑菌機(jī)制研究以及田間試驗(yàn)等方面開展大量研究。