根瘤菌回接對蠶豆生長及抗根腐病能力的影響

王金華 聶中良 徐玉巧 鄭 毅

(1. 云南農業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明 650201；2. 西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明 650224；3. 云南省教育廳，云南 昆明 650223)

蠶豆 (Viciafaba) 是我國主要的豆類作物之一，具有豐富的營養(yǎng)價值。由鐮孢菌 (Fusariumspp.) 為優(yōu)勢病原菌引起的蠶豆根腐病是蠶豆生產的主要限制因素，對蠶豆種植區(qū)的危害非常嚴重，一般發(fā)病率在20%～30%，減產80%，甚至絕收[1]。尖孢鐮刀菌 (Fusariumoxysporum) 屬于鐮孢菌，可分泌3種細胞壁降解酶，通過降解植物細胞壁產生果膠阻塞宿主植物導管，影響水分吸收，導致植物萎蔫致死[2]。目前蠶豆根腐病主要生防細菌為芽孢桿菌 (Bacillus) 和假單胞桿菌 (Pseudomonas)，具有明顯的抗病和促生長作用[3-5]。

根瘤菌廣泛存在于植物根際土壤，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的根瘤菌有12個屬51個種[6-7]，可通過侵染根毛形成根瘤與豆科植物共生固氮，為植物生長提供氮素，是一種有效的豆科植物促生菌，因而能使植物在苗期茁壯生長，增加對土傳病害的抗病能力[8]。本實驗著重研究根瘤菌回接后對患根腐病蠶豆的拮抗作用及促生長效應，為蠶豆根腐病的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1) 供試蠶豆：蠶豆89-147，購自云南省農業(yè)科學院。

2) 供試土壤：西南林業(yè)大學試驗田耕層土壤。

3) 供試菌株：根瘤菌SWFU55-1、SWFU55-2、SWFU48-1是從文山三葉草中分離到的根瘤菌株，為根瘤菌屬 (Rhizobiumsp.)；蠶豆根腐病致病菌為鐮孢菌MX20，寄主為蠶豆。菌種均由西南林業(yè)大學生命科學學院微生物菌種保藏中心提供。

4) 培養(yǎng)基：1) YEM培養(yǎng)基：甘露醇10 g，酵母提取物10 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，瓊脂17 g，蒸餾水補充至終體積1 L，pH 6.8，121 ℃，滅菌20 min。2) PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 L水，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1根瘤菌與鐮孢菌的拮抗實驗

拮抗實驗采用平板對峙法進行。將供試根瘤菌分別與鐮孢菌XM20接入同一個PDA平板，相隔5 cm，28.5 ℃恒溫培養(yǎng)，直到對照組鐮孢菌菌絲長滿整個平板，每個處理重復3次。根據(jù)實驗組鐮孢菌生長情況初步篩選出有拮抗作用的根瘤菌，記錄抑菌帶并計算抑菌率[9]，測定拮抗菌株抑菌活性。

抑菌帶寬度=處理菌落長直徑-處理菌落短直徑

1.2.2根瘤菌、鐮孢菌回接蠶豆實驗

1) 菌懸液制備。挑取SWFU55-1、SWFU55-2、SWFU48-1菌體制成濃度相同的菌懸液，取2 mL菌懸液接種于200 mL YEM液體培養(yǎng)基中，28.5 ℃，170 r/min恒溫搖床培養(yǎng)，至OD600為1.4時待用。XM20接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28.5 ℃恒溫培養(yǎng)，至其產生大量分生孢子時，用無菌水制成孢子濃度為1.0 × 106個/mL的懸液，備用。

2) 蠶豆栽種及病原菌接種：取蠶豆種子，經2%次氯酸鈉表面消毒10 min，無菌水沖洗后，分別浸泡于100 mL拮抗根瘤菌懸液中，過夜后播種于口徑30 cm的塑料花盆中，每盆種10粒種子，每個處理種4盆，以100 mL無菌水浸泡的蠶豆為對照組 (CK組)，于溫室中正常田間管理。發(fā)芽后去除長勢不好的蠶豆，最后每盆保留6株蠶豆苗。在蠶豆開花前 (蠶豆播種后5周) 用無菌刀片將蠶豆根莖基部距離土面上方1 cm處劃破一個斜口，采用下胚軸接種法將XM20孢子懸液以10 mL/株的量分別接種于下胚軸創(chuàng)傷處，實驗設計見表1。每個實驗組取3組有效重復數(shù)據(jù)，正常田間管理，觀察測量蠶豆各項生長指標。于接種XM20孢子懸浮液后開始觀察發(fā)病情況。

表1 根瘤菌、鐮孢菌回接實驗設計表Table 1 Inoculation design of Rhizobia and F.oxysporum

1.3 測定及分析方法

1.3.1蠶豆植株生長及含氮量的測定

蠶豆各項生長指標統(tǒng)計：蠶豆播種后3周開始測量各實驗組蠶豆植株的株高 (游標卡尺) 等生長指標；蠶豆播種后6周統(tǒng)計植株分蘗數(shù)、冠幅；蠶豆開花6周后收獲豆莢，統(tǒng)計結瘤數(shù)、結莢數(shù)。

蠶豆植株根莖含氮量的測定：蠶豆收獲后，拔出植株，取各組樣本在研缽中磨碎，各取已磨碎的蠶豆根、莖樣品0.100 0 g，加入濃硫酸進行硝化，消解后靜置冷卻，用Foss-凱氏定氮儀進行含氮量測定。

1.3.2蠶豆根腐病病害評價及發(fā)病率統(tǒng)計

葉片病斑率分別于蠶豆接入鐮孢菌后3、4、5、6、7 d進行測定。

接種鐮孢菌7 d后，參照程亮[10]的方法對病株進行根腐級別調查和評價，統(tǒng)計各級發(fā)病株數(shù)，計算病情指數(shù)，描述抗性。

1.3.3實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用SPSS 17.0軟件和Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗 (LSD法，P=0.05)。

2 結果與分析

2.1 根瘤菌對MX20的抑制作用

在對峙培養(yǎng)過程中，MX20靠近各供試根瘤菌處，菌絲變黃、死亡或者不生長，出現(xiàn)寬度不等的抑菌帶 (圖1)，且抑菌帶可維持7 d，這表明各根瘤菌對MX20的生長均有一定的抑制作用。由表2可知，SWFU55-1抑菌帶最寬，約為5.5 mm，顯著高于另2株菌，抑菌效果最好；SWFU48-1的抑菌帶略大于SWFU55-2，但差異不顯著。菌株SWFU55-1、SWFU55-2、SWFU48-1對MX20的抑菌率分別為55%、38%、40%，SWFU55-1的抑菌率顯著高于SWFU55-2和SWFU48-1。

圖1 根瘤菌對鐮孢菌抑制效果Fig.1 The inhibition of Rhizobia on MX20

表2 根瘤菌SWFU55-1、SWFU55-2、SWFU48-1對鐮孢菌MX20的抑制效果Table 2 The inhibition of Rhizobia strains SWFU55-1, SWFU55-2, SWFU48-1 on MX20

2.2 根瘤菌回接對蠶豆植株生物量的影響

2.2.1根瘤菌回接對蠶豆植株株高的影響

蠶豆播種后3周開始測定高生長量，見表3。由表3可知，3株根瘤菌回接對蠶豆植株均表現(xiàn)出一定的生長促進作用，但促生效應不同，總體趨勢為根瘤菌組 > 根瘤菌 + MX20組 > CK > MX20組。實驗組III在第6次 (蠶豆播種8周) 觀察時株高最高，為40.03 cm，顯著高于只接根瘤菌的I、II組，根瘤菌 + MX20組和CK組，其周增長率為5.01 cm/周，長勢最強，由此可知根瘤菌的單純促生長作用為SWFU48-1 > SWFU55-2 > SWFU55-1；在同時接種根瘤菌和鐮孢菌的實驗組中，株高最高的是VI組，為33.78 cm，顯著高于IV、V組；VI組增長率為4.67 cm/周，顯著強于IV、V組，長勢最強；長勢最弱的是只接鐮孢菌MX20的VII組，低于CK組，但差異不顯著，在6周的時間內蠶豆植株生長逐漸減緩。

表3 根瘤菌接種對蠶豆植株長勢的影響Table 3 The effect of Rhizobium inoculate on the growth of V.faba

因為根瘤菌的單純促生長能力為SWFU48-1 > SWFU55-2 > SWFU55-1，所以在根瘤菌 + MX20接種實驗中，表現(xiàn)出的促生長總趨勢為，SWFU48-1顯著強于SWFU55-1和SWFU55-2，SWFU55-1和SWFU55-2差異不顯著。綜合抗病能力表現(xiàn)為SWFU48-1強于SWFU55-2與SWFU55-1。

2.2.2根瘤菌回接對蠶豆植株生長及含氮量的影響

根瘤菌對蠶豆生長、結瘤及含氮量的影響見表4。

表4 根瘤菌對蠶豆生長、結瘤及含氮量的影響Table 4 The effect of Rhizobium on growth, nodule and nitrogen content of V.faba

由表4可知，植株冠幅、分蘗數(shù)、結瘤數(shù)、結莢數(shù)及植株N含量等參數(shù)在各實驗組中均表現(xiàn)為 “根瘤組” > “根瘤菌 + MX20組” > “空白組” > “MX20組” 的趨勢。1) 平均冠幅II、III組最大，分別超過對照組21.84%、38.65%，顯著大于對照組；VII組冠幅顯著小于對照組，其余組間差異不顯著，表明根瘤菌回接有助于植株徑向生長。2) 回接根瘤菌的各實驗組分蘗數(shù)無顯著差異，但顯著多于未回接根瘤菌的VII和CK組，說明根瘤菌回接有助于蠶豆植株的分蘗。3) 蠶豆平均結瘤數(shù)比較結果為：VI > III > II > V > I > IV > CK > VII，“根瘤組中” III組顯著多于I、II組， “根瘤菌 + MX20” 組中VI組顯著多于IV、V組，可見根瘤菌的結瘤能力為SWFU48-1強于SWFU55-2與SWFU55-1，該結果與根瘤菌促生長結果相符。4) 平均結莢數(shù)比較結果為：III > VI > II > V > I > IV > CK > VII，SWFU48-1回接的蠶豆結莢數(shù)顯著多于SWFU55-2和SWFU55-1，蠶豆增產效果顯著；VII組結莢數(shù)極少，因為其植株患病幾乎沒有抵抗能力，幾近死亡，所以無莢或少莢。5) 通過對蠶豆根、莖含氮量測定，發(fā)現(xiàn)回接SWFU48-1可以顯著提高蠶豆根、莖含氮量，III組根、莖含氮量分別比CK組高67.84%、33.07%，患病VI組根、莖含氮量分別比VII組高238.55%、16.30%；SWFU55-1可以顯著提高蠶豆根、莖部氮含量；SWFU55-2可顯著提高蠶豆根部含氮量，但對莖含氮量影響不顯著。蠶豆患根腐病后，除VI組外，其余各組根部含氮量顯著降低；莖部含氮量變化不顯著。根瘤菌對蠶豆植株含氮量影響能力為SWFU48-1?SWFU55-1 > SWFU55-2。

由表4可知，根瘤菌回接后，根腐病對蠶豆的冠幅、分蘗數(shù)、結瘤數(shù)、結莢數(shù)、植株莖含氮量等各參數(shù)的影響不顯著；但對根部含氮量影響顯著；不回接根瘤菌 (VII組和CK組)，則影響顯著。由此可見，根瘤菌對蠶豆的營養(yǎng)生長和抗根腐病的能力均有一定的促進作用，促進能力為SWFU48-1 > SWFU55-1 > SWFU55-2。

2.2.3根瘤菌回接對蠶豆抗根腐病能力的影響

IV，V，VI 3組實驗中，VI組發(fā)病慢，發(fā)病率低，3 d病斑率為8.33%，5 d時出現(xiàn)條斑，根部腐爛、植株死亡等情況要低于IV、V組 (見表5)；第7天時，未出現(xiàn)植株死亡。由此可見根瘤菌SWFU48-1對由MX20引起的根腐病的防治效果優(yōu)于SWFU55-1、SWFU55-2。

表5 不同根瘤菌回接對蠶豆根腐病病斑率變化和抗性評價Table 5 Spot rate change and field resistance evaluation of different Rhizobia stains to root rot on V.faba

3 結論與討論

在離體條件下，根瘤菌對MX20的生長均表現(xiàn)出不同程度的拮抗作用，可能是因為根瘤菌在生長過程中分泌某些抗菌次級代謝產物或胞外酶[11-12]，抑制MX20的生長和代謝，致使菌絲變黃、死亡或溶解。

根瘤菌SWFU48-1的結瘤作用最強，可能是因為根瘤菌SWFU48-1與蠶豆匹配性最佳，能夠快速結瘤形成有效根瘤，建立有效的共生體系，為蠶豆植株提供氮素，進而促進生長，所以與促生長作用表現(xiàn)出相同的趨勢。

在進行蠶豆株高的第3次 (蠶豆播種后5周) 測試時，III組、VI組的植株株高、長勢顯著提高，可能是在前期SWFU48-1通過有效結瘤逐漸發(fā)揮固氮作用，為植株提供了充足的氮素營養(yǎng)，促進蠶豆生長。在第4次 (鐮孢菌接種后1周) 檢測株高時發(fā)現(xiàn)，所有蠶豆株高增長速度減緩，可能是接種MX20后蠶豆的生長因根腐病的影響而受到抑制，經過約2周的對抗緩沖期后，蠶豆體內合成并積累了一定的抗病物質，可以抑制鐮孢菌的生長和繁殖，減輕其對植株的危害，降低致病效應，故抗病能力強的蠶豆逐漸恢復生長，表現(xiàn)出顯著的長勢增加。

蠶豆患根腐病后根部含氮量顯著降低，因為鐮孢菌是典型的土傳病害，首先侵襲的蠶豆根部，而根部正是根瘤所在部位，因而影響根瘤菌的固氮作用，降低根部的含氮量。

在盆栽種植條件下，蠶豆的各項生長指標均出現(xiàn) “根瘤組” > “根瘤菌 + MX20組” > “空白組” > “MX20組” 的趨勢，植物根部拮抗細菌可提高植株抗病性[13-14]。根瘤菌對蠶豆的促生長作用和抗病能力與離體條件下的對峙培養(yǎng)拮抗作用稍有差別，即對峙實驗抑菌強度SWFU55-1 > SWFU48-1 > SWFU55-2，盆栽實驗則表現(xiàn)為SWFU48-1 > SWFU55-1 > SWFU55-2，可能是因為SWFU48-1結瘤、固氮、促生長作用最強，促進植物的須根生長及根部功能，在前期營養(yǎng)生長時儲備了足夠的營養(yǎng)，所以生長旺盛，產量高，抗病能力強，所以在接種MX20后綜合抗病能力較強，表現(xiàn)為SWFU48-1強于SWFU55-2與SWFU55-1。根瘤菌拮抗抑菌作用受到很多環(huán)境條件的影響，如位點競爭、占瘤率、有效共生體系的構建、固氮效率等，由此綜合影響植物的誘導系統(tǒng)抗性。因此根瘤菌作為生物菌劑在離體條件下的拮抗能力不能代表實際應用的效果，要根據(jù)實際環(huán)境條件篩選高效促生長、抗病能力強的菌株。

本研究通過根瘤菌與鐮孢菌的離體對峙培養(yǎng)和盆栽實驗得出：離體培養(yǎng)條件下，根瘤菌對鐮孢菌的生長有抑制作用，抑菌效果SWFU55-1最強；栽種條件下，根瘤菌的促生長作用和抗病能力強度為SWFU48-1 > SWFU55-1 > SWFU55-2；根瘤菌回接可以顯著提高蠶豆結瘤率、株高、分蘗數(shù)和植株含氮量，長勢旺盛，表明根瘤菌可以通過有效結瘤與豆科植物構建共生固氮系統(tǒng)，為植株提供充足氮素，促進植株生長和增產；長勢旺盛的蠶豆植株根腐病發(fā)病慢，發(fā)病率低，無死株，表明根瘤菌回接可以促進生長而顯著提高蠶豆植株抗根腐病能力。