供肝能量代謝與肝移植術(shù)后缺血性膽管損傷的關(guān)系探討

孫曉葉，康永振，沈中陽(yáng)（.天津市第一中心醫(yī)院移植外科，天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津3009；.天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院，天津 30800）

肝移植已成為治療各種終末期肝臟病的重要手段［1］。肝臟移植技術(shù)的迅速發(fā)展和成熟使得手術(shù)成功率得到大幅提升，但術(shù)后缺血性膽管損傷（ischemic-type biliary lesions，ITBL）的發(fā)生及其處理對(duì)策一直是影響肝移植受者生存率和生活質(zhì)量的重要因素，對(duì)ITBL的發(fā)生進(jìn)行及早預(yù)測(cè)和臨床干預(yù)意義重大。本研究旨在通過(guò)比較肝移植術(shù)后1年內(nèi)發(fā)生ITBL的患者（ITBL組）與未發(fā)生ITBL的患者（NITBL組）的供肝能量?jī)?chǔ)備，探討其對(duì)術(shù)后1年內(nèi)ITBL的發(fā)生是否具有預(yù)測(cè)價(jià)值以及具有何種預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象：自2014年3月1日- 2015年8月31日于天津市第一中心醫(yī)院接受原位肝臟移植手術(shù)并滿足以下入組標(biāo)準(zhǔn)的患者：① 年齡≥16歲；② 首次接受肝臟移植手術(shù)；③ 術(shù)前原發(fā)病為膽道疾病，如原發(fā)性硬化性膽管炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等不在本研究之列；④ 術(shù)前無(wú)膽道感染、膽道手術(shù)及膽系結(jié)石等膽道相關(guān)并發(fā)癥；⑤ 無(wú)不可控制的全身感染，術(shù)中留置T管，預(yù)計(jì)術(shù)后生存時(shí)間1年以上。研究期間符合入組標(biāo)準(zhǔn)病例共150例，其中男性133例，女性17例；平均年齡（49.5±9.3）歲；終末期肝臟?。╩odel for end stage liver disease，MELD） 評(píng)分為6～41分，平均（16.3±8.7）分；Child-Pugh分級(jí)A級(jí)38例，B級(jí)57例，C級(jí)55例；原發(fā)疾病情況如表1所示。入組患者于肝移植手術(shù)過(guò)程中分別于門靜脈開(kāi)放前、肝動(dòng)脈開(kāi)放前和肝動(dòng)脈開(kāi)放后1小時(shí)留取供肝組織標(biāo)本。

1.2 供體資料：供肝切取采用改良的腹腔器官聯(lián)合快速切取方式，經(jīng)腸系膜上靜脈插管灌注門靜脈，灌注液使用腎臟保存液，灌注量3000 ml；腹主動(dòng)脈灌注液類型及灌注量同門靜脈灌注；膽道灌注使用生理鹽水250 ml。150例患者均接受經(jīng)典原位肝移植術(shù)，其中男性93例，女性57例，平均年齡（32.3±8.1）歲，供受體血型均相合。供肝重量769～1360 g，平均（1068.5±181.5） g。供肝冷缺血時(shí)間1～16.5小時(shí)，平均 （7.2±3.1）小時(shí)，供肝熱缺血時(shí)間1～5分鐘，平均（2.7±1.4）分鐘，膽道二次熱缺血時(shí)間20～60分鐘，平均（32.2±7.1）分鐘，無(wú)肝期25～83分鐘，平均（46.5±12.4）分鐘。術(shù)中輸血量1800～8200 ml，輸液1450～12200 ml，術(shù)中出血550～6000 ml。

表1 入組患者原發(fā)病情況

1.3 標(biāo)本的留取與測(cè)定：取供肝2 g，迅速置于0℃線粒體緩沖液。反復(fù)清洗后，應(yīng)用手動(dòng)勻漿器勻漿，4℃下以2000 r/min離心10分鐘，留置上清液，再以10000 r/min離心7分鐘。倒出大部分上清，加2 ml線粒體緩沖液進(jìn)行懸浮沉淀，12000 r/min離心7分鐘，棄上清。留沉淀加線粒體緩沖液1 ml，用吸管輕輕懸浮，此為最后制備的線粒體懸液（各種操作都在0～4℃內(nèi)進(jìn)行）。將線粒體懸液0.1 ml，加入冰冷的1.6 mol/L的HClO40.2 ml，0℃靜置5分鐘后，予4℃下12000 r/min離心15分鐘，取上清液用2.5 mol/L的K2CO3中和（調(diào)pH至6.5），充分混合，0℃靜置10分鐘后，再次4℃下12000 r/min離心15分鐘，取上清液20 μl行高壓液相色譜分離并檢測(cè)ATP、ADP和AMP含量。

色譜條件：色譜柱：Kromasil C18（150 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：0.1 mol/L的磷酸緩沖液；流速：1.0 ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫為室溫；靈敏度：0.005（AUFS）；進(jìn)樣量為20 μl。以上檢測(cè)均由天津醫(yī)科大學(xué)新科技應(yīng)用研究所中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.4 臨床分組：對(duì)所有患者進(jìn)行為期1年的隨訪觀察，去除死亡的病例后，根據(jù)膽道造影結(jié)果將所有患者區(qū)分為ITBL組和NITBL組。膽道造影具有如下改變定為ITBL組：① 供體側(cè)肝內(nèi)外膽管局灶或彌漫性狹窄或擴(kuò)張；② 肝內(nèi)3級(jí)以上末梢膽管充盈不良或顯影淺淡；③ 肝內(nèi)膽管不規(guī)則如形態(tài)僵硬，管壁欠規(guī)整；④ 供體側(cè)肝內(nèi)外膽管局灶或彌漫性充盈缺損影。正常膽道造影及ITBL組彈道造影如圖1和圖2。

圖1 正常膽道造影表現(xiàn)

圖2 ITBL膽道造影表現(xiàn)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：將所有測(cè)得的結(jié)果按照是否發(fā)生ITBL進(jìn)行分組整理并進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能量代謝指標(biāo)ATP、ADP及AMP的檢測(cè)結(jié)果不符合正態(tài)分布，使用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ITBL發(fā)生情況：入組的150例患者中，共有32例患者在肝移植術(shù)后3個(gè)月內(nèi)確診為ITBL，其中2例患者于肝移植術(shù)后4個(gè)月、5個(gè)月分別死于肝功能衰竭、間質(zhì)性肺炎，實(shí)際存活并完成隨訪ITBL患者30例，ITBL發(fā)生率為21.13%；余未發(fā)現(xiàn)ITBL患者118例，其中4例患者分別于術(shù)后1周、1個(gè)月、2個(gè)月、9個(gè)月死于腦出血、感染性休克、肝癌復(fù)發(fā)、呼吸功能衰竭，2例患者分別于術(shù)后第3天和第20天因腦出血和腹腔感染自動(dòng)出院失訪，實(shí)際存活并完成隨訪非ITBL患者112例。

2.2 分組情況：30例ITBL組患者，原發(fā)疾病中乙型肝炎后肝硬化11例，乙肝后肝硬化合并肝癌10例，丙肝后肝硬化2例，酒精性肝硬化2例、原發(fā)性肝癌、丙型肝炎后肝硬化合并肝癌、隱源性肝硬化、藥物性肝衰竭、毛細(xì)血管擴(kuò)張癥各1例。此30例發(fā)生ITBL患者均無(wú)肝動(dòng)脈血管相關(guān)并發(fā)癥。由此，142例入組患者分為ITBL組與NITBL組，分別包括病例數(shù)30例和112例。

2.3 肝組織能量代謝與ITBL的發(fā)生關(guān)系（表2）：將所測(cè)得肝組織標(biāo)本中能量代謝相關(guān)數(shù)據(jù)整理統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，ITBL組與NITBL組在門靜脈開(kāi)放前、肝動(dòng)脈開(kāi)放前、肝動(dòng)脈開(kāi)放后3個(gè)時(shí)間段的能量代謝相關(guān)指標(biāo)，即ATP、ADP及AMP含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

肝移植已成為治療各種終末期肝臟疾病的重要手段［2-3］，臨床上無(wú)論國(guó)內(nèi)國(guó)外都得到了廣泛的開(kāi)展與推廣。肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥表現(xiàn)多樣，ITBL是其中最常見(jiàn)和最難處理的類型［4］，對(duì)移植受者的危害也最為嚴(yán)重，一旦發(fā)生，治療時(shí)間漫長(zhǎng)，病情反復(fù)，治療效果欠佳的同時(shí)患者本人既忍受病痛的折磨，也承受著巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力［5-6］。

表2 不同時(shí)間段ITBL組與非ITBL組肝組織能量代謝指標(biāo)比較結(jié)果

考慮到部分患者在膽道已有病變時(shí)可能尚未出現(xiàn)肝臟酶學(xué)指標(biāo)或血清總膽紅素水平的升高，且肝臟酶學(xué)指標(biāo)或膽紅素水平的升高受其他非膽道因素的影響較大，我們對(duì)ITBL的診斷主要依靠膽道造影結(jié)果。同時(shí)，將膽道造影顯示膽道形態(tài)不規(guī)則、管壁僵硬和膽道充盈不良、分支稀疏的病例納入診斷，以往的診療經(jīng)驗(yàn)提示我們肝移植術(shù)后早期膽道造影結(jié)果顯示膽道形態(tài)不規(guī)則和膽道充盈不良對(duì)以后患者發(fā)生ITBL的敏感度和特異度可分別高達(dá)72.22%和87.44%［7］，將這部分患者排除在研究之外將會(huì)大大提高研究的假陰性率；肝移植術(shù)后非吻合口部位的膽泥形成可以是ITBL的繼發(fā)改變，常常繼發(fā)于膽管已有損害的基礎(chǔ)上，特別是局灶性部位膽泥進(jìn)行網(wǎng)籃清理后常可發(fā)現(xiàn)膽泥形成部位伴有狹窄形成，因此我們的研究也將其納入在研究之內(nèi)。

肝移植術(shù)后ITBL的確切發(fā)病機(jī)制至今不明，但可以肯定是多因素共同作用的結(jié)果，涉及到從供肝切取后的灌注、保存、修整到供肝植入時(shí)肝動(dòng)脈吻合再到術(shù)后抗排斥和巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染的整個(gè)肝臟移植過(guò)程，文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)危險(xiǎn)因素包括供肝缺血時(shí)間、缺血/再灌注損傷、膽道二次熱缺血損傷、排斥反應(yīng)發(fā)生、CMV感染和膽汁酸鹽毒性甚至微小RNA［8-14］等。盡管每個(gè)移植肝臟都要經(jīng)歷熱缺血、冷缺血、膽道相對(duì)熱缺血和再灌注損傷，但只有一部分發(fā)生ITBL。雖然各種缺血時(shí)間延長(zhǎng)可增加ITBL的發(fā)生幾率，但缺血時(shí)間與ITBL并無(wú)可供統(tǒng)計(jì)的完全對(duì)應(yīng)關(guān)系。ATP既是生物體內(nèi)可以直接利用的能源，又是細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)反應(yīng)和功能的能量所在，研究發(fā)現(xiàn)，組織缺血時(shí)間越長(zhǎng)，ATP含量降低越明顯［15］，再灌注時(shí)其損傷度不但沒(méi)有改善，反而會(huì)進(jìn)一步加重［16］。缺血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則組織ATP水平無(wú)法恢復(fù)［17］。而當(dāng)能量合成障礙時(shí)，離子泵功能受損，細(xì)胞腫脹壞死，細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡。因此課題設(shè)計(jì)之初我們推測(cè)ITBL的發(fā)生可能是因?yàn)槊恳粋€(gè)移植肝臟本身能量?jī)?chǔ)備不同，對(duì)缺血和損傷的耐受程度也不同，即使缺血時(shí)間差別不大，最終的組織損害和ITBL的發(fā)生率也不盡相同。由此我們進(jìn)行了此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，旨在探究肝移植手術(shù)過(guò)程中血管開(kāi)放前后供肝能量代謝與肝移植術(shù)后缺血性膽管損傷的發(fā)生的關(guān)系。然而遺憾的是，根據(jù)我們的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，ITBL組與NITBL組在門靜脈開(kāi)放前、肝動(dòng)脈開(kāi)放前、肝動(dòng)脈開(kāi)放后1小時(shí)等時(shí)間段的能量代謝相關(guān)指標(biāo)，即ATP、ADP及AMP含量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示我們肝組織能量代謝情況與肝移植術(shù)后ITBL的發(fā)生可能并無(wú)相關(guān)性。但由于本研究樣本量較小，在大規(guī)模樣本量研究項(xiàng)目中是否支持以上結(jié)論還需進(jìn)一步研究。