甲基硫菌靈對季節(jié)性栽培雙孢蘑菇褐腐病的生物活性及田間防效和安全性評價

張 怡， 錢忠海， 劉 琴， 王林貴， 沈迎春

(1.江蘇省農(nóng)藥檢定所，江蘇南京 210036； 2.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚州 225007；3.江蘇省南京市高淳區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，江蘇南京 211300)

我國食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，為我國農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收、循環(huán)農(nóng)業(yè)的發(fā)展發(fā)揮了重要作用。然而隨著食用菌周年生產(chǎn)和栽培規(guī)模的日益擴大，食用菌病害的發(fā)生與危害呈現(xiàn)逐年加重的趨勢，成為制約食用菌產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要因素。一方面病蟲害對產(chǎn)量造成嚴(yán)重的影響，一般損失量達(dá)食用菌產(chǎn)量的20%～30%，嚴(yán)重時可達(dá)50%，甚至絕收[1]；另一方面病害使食用菌產(chǎn)品品質(zhì)降低，經(jīng)濟效益大幅下降，嚴(yán)重挫傷了菇農(nóng)的生產(chǎn)積極性。

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)是食用菌的一個重要品種，是目前世界上栽培最廣泛、栽培量最大的食用菌品種，雙孢蘑菇在分類上屬于真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，蘑菇屬。雙孢蘑菇褐腐病又稱蘑菇濕泡病，是由有害疣孢霉菌(Mycogoneperniciosa)引起的一種嚴(yán)重病害[2]。疣孢霉菌的分生孢子和厚垣孢子只感染蘑菇子實體，不感染菌絲體。在不同發(fā)育階段侵染雙孢蘑菇，其癥狀不同。在雙孢蘑菇子實體分化前侵染，可形成白色棉狀菌團(tuán)，分不清菇蓋與菇柄，切開其剖面可見菌柄中空，柄基部膨大。在雙孢蘑菇菇蓋與菇柄分化后被侵染，在菇床上菇蕾較短矮，初期其顏色略暗淡、無光澤，菇蓋表面凹凸不平，之后病菇長出一層白色絨毛狀菌絲體及分生孢子，發(fā)病后期病菇上出現(xiàn)透明的暗褐色液滴，并伴有腐敗的臭味，最后病菇壞死且呈濕腐狀[2]。其菌絲生長和分生孢子萌發(fā)適宜的溫度為25 ℃，高濕有利于菌絲生長和孢子萌發(fā)[3]，因此，在我國福建、四川、江蘇、浙江等地區(qū)常有發(fā)生。發(fā)生病害的菇房產(chǎn)量減少10%～25%，病害發(fā)生特別嚴(yán)重的菇房減產(chǎn)達(dá)50%～60%。長期以來褐腐病防治主要依賴通風(fēng)消毒等物理防治，而此類方法通常見效較慢、無法滿足病害嚴(yán)重發(fā)生時的防治需求。目前，雙孢蘑菇褐腐病的化學(xué)防治研究較少，使用殺菌劑常常由于病原菌和雙孢蘑菇具有相似性，在農(nóng)藥選擇上存在一定困難，因此藥劑儲備不足[4]。生產(chǎn)上常用多菌靈與百菌清進(jìn)行防治，但易產(chǎn)生抗藥性與殘留風(fēng)險[5]。本試驗擬考察甲基硫菌靈對季節(jié)性栽培雙孢蘑菇的安全性及對褐腐病室內(nèi)毒力和田間防效的表現(xiàn)，篩選出合理的用藥品種和實際應(yīng)用技術(shù)，以期解決食用菌生產(chǎn)上的用藥問題，保障其生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 雙孢蘑菇、有害疣孢霉菌，均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病理研究室保存。

馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL。培養(yǎng)基置于黑暗培養(yǎng)箱，溫度設(shè)定為28 ℃。

1.1.2 供試藥劑 97.0%甲基硫菌靈原藥，購自江蘇嘉隆化工有限公司；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，購自江蘇龍燈化工有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 儀器設(shè)備主要有量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、移液槍、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、直尺、JN-16C型背包式噴霧器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 室內(nèi)毒力測定 在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，分別配制含 0.05、0.10、0.50、1.00、10.00 mg/L甲基硫菌靈的PDA培養(yǎng)基帶藥平板，并設(shè)不加藥平板作對照。采用NY/T 1156.2—2006規(guī)定的平皿菌絲生長抑制法[6]，將雙孢蘑菇、疣孢霉菌接在PDA培養(yǎng)基平板上，于25 ℃預(yù)培養(yǎng)7 d，然后用直徑為 5 mm 的打孔器在靠近菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅(保證同一重復(fù)供試病菌的菌齡相同)，并用接種針在無菌條件下將菌餅接種到帶藥平板中央，菌絲面朝下，并設(shè)不加藥平板作對照，置于黑暗條件下培養(yǎng)。每個處理4次重復(fù)。培養(yǎng)7 d后測量菌落直徑，求出4次重復(fù)的平均值，得出各處理的菌落增長直徑(菌落增長直徑=菌落直徑-5 mm)。

1.2.2 田間藥效試驗 田間試驗于2016年在江蘇省南京市高淳區(qū)東壩鎮(zhèn)游子山食用菌基地進(jìn)行，試驗對象為雙孢蘑菇，品種為AS2796。所有生長條件同常規(guī)季節(jié)性雙孢蘑菇生產(chǎn)，試驗的基本要求和方法參考《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則(一)》[7]中相應(yīng)試驗內(nèi)容。菇棚為南北走向，每棚都有2排鋼筋混凝土床架，在棚內(nèi)分列東西兩邊，每排床架為3層，每層有5個相等的小區(qū)，小區(qū)面積為1.4 m×4.0 m。選擇基地發(fā)病早且嚴(yán)重的菇棚作為試驗菇棚，于春菇生長的盛期施藥，在施藥當(dāng)天不進(jìn)行噴水作業(yè)，其余田間管理參照正常管理。選用生產(chǎn)中常用的器械，記錄所有器械的類型和操作條件(如工作壓力、噴孔口徑等)。施藥應(yīng)保證藥量準(zhǔn)確，分布均勻。用藥量偏差超過±10%的要進(jìn)行記錄。第1次施藥時間為2016年3月23日，3月30日調(diào)查藥效后，噴施第2次藥，施藥時菇棚內(nèi)處于春菇出菇盛期。試驗設(shè)置空白對照與3個試驗劑量，即0.4、0.8、1.6 g a.i./m270%甲基硫菌靈可濕性粉劑。分別于第2次噴藥7、13、17、25、32、38、45 d后調(diào)查各小區(qū)全部培養(yǎng)料上罹病的菇粒數(shù)或菌團(tuán)數(shù)(對于菇?；蚓鷪F(tuán)≥1 cm者計數(shù))。重點觀察藥劑對作物生長的影響，觀察藥劑有無推遲子實體原基發(fā)生、對子實體有無藥害，若有藥害，要記錄藥害的類型和程度，此外，也應(yīng)記錄對蘑菇的有益影響(如促進(jìn)生長等現(xiàn)象)。如果藥害能被測量或計算，要用絕對數(shù)值表示，其他情況下，可以按下列2種方法估計藥害程度和概率：按照藥害分級方法記錄每個小區(qū)的藥害情況，以-、+、++、+++、++++表示(表1)；將藥劑處理區(qū)與空白對照區(qū)進(jìn)行比較，評價其藥害的百分率。同時，要準(zhǔn)確描述雙孢蘑菇的藥害癥狀，并提供實物照片、錄像等。對其他病蟲害的任何影響都應(yīng)記錄，包括有益和無益的影響。

1.3 計算方法

計算藥劑對病菌的菌絲生長抑制率，然后將抑制率轉(zhuǎn)化成概率值(y)，濃度轉(zhuǎn)化成對數(shù)值(x)，求出各藥劑對雙孢蘑菇的毒力回歸曲線方程(y=a+bx)，以及有效抑制中濃度(EC50)、相關(guān)系數(shù)等。

表1 藥害分級方法

防治藥效=[對照區(qū)病菇(菌團(tuán))數(shù)量-處理區(qū)病菇(菌團(tuán))數(shù)量]/[對照區(qū)病菇(菌團(tuán))數(shù)量]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)毒力測定結(jié)果

由表2、表3可知，97.0%甲基硫菌靈對雙孢蘑菇菌絲生長的抑制率在5.99%～33.02%之間，對疣孢霉菌菌絲生長的抑制率在1.18%～34.90%之間。在離體條件下，97.0%甲基硫菌靈原藥對雙孢蘑菇和疣孢霉菌均有一定的抑制作用，其有效抑制中濃度分別為67.893 1、50.275 7 mg/L。其對雙孢蘑菇菌絲生長的抑制濃度高于疣孢霉菌菌絲生長的抑制濃度，說明甲基硫菌靈對雙孢蘑菇較安全，可用于雙孢蘑菇褐腐病的防治。供試殺菌劑對雙孢蘑菇疣孢霉菌的毒力測定結(jié)果表明，甲基硫菌靈對疣孢霉菌的毒力一般。

表2 甲基硫菌靈對雙孢蘑菇、疣孢霉菌菌絲生長的抑制情況

表3 97.0%甲基硫菌靈對雙孢蘑菇、疣孢霉菌菌絲生長的室內(nèi)毒力測定結(jié)果

2.2 田間藥效試驗結(jié)果

由圖1可知，試驗期間，氣溫在8～25 ℃之間，相對濕度在28%～100%之間，條件較適于雙孢蘑菇褐腐病病菌菌絲生長。清水對照處理雙孢蘑菇褐腐病發(fā)生中等，雙孢蘑菇子實體可見白色棉狀菌團(tuán)，分不清菇蓋與菇柄，柄基部膨大。試驗后期，由于溫度升高，同時菇棚內(nèi)維持較高的濕度(60%～80%)，雙孢蘑菇褐腐病發(fā)生嚴(yán)重，少數(shù)病菇菇蓋表面凹凸不平，部分病菇長出一層白色絨毛狀菌絲體及分生孢子，極少數(shù)病菇上出現(xiàn)透明的暗褐色液滴，并伴有腐敗的臭味。

由表4可知，第2次噴藥后，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對雙孢蘑菇褐腐病的防效在47.2%～100.0%之間，防治效果均隨用藥量增加而遞增。其速效性較好，噴藥7 d后，高劑量70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對雙孢蘑菇褐腐病的防效可達(dá)100.0%；持效性一般，噴藥25 d后的防效與噴藥7 d后的防效相比有所下降，防效在47.2%～83.3%之間。田間觀察結(jié)果表明，在試驗范圍內(nèi)，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑噴藥 2 d 后就出現(xiàn)輕微藥害，主要藥害癥狀是菇體表面發(fā)黃，6 d后70%甲基硫菌靈可濕性粉劑處理中雙孢蘑菇能恢復(fù)正常生長，新出菇也能正常生長。

表4 70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對雙孢蘑菇褐腐病的防治效果

注：防效數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

由于雙孢蘑菇褐腐病病原菌與雙孢蘑菇具有一定的生物同源性，因此在篩選防治蘑菇褐腐病的殺菌劑時，必須考慮防效及對蘑菇生長的影響。本研究結(jié)果表明，甲基硫菌靈對疣孢霉菌表現(xiàn)出較為理想的室內(nèi)活性，在離體條件下，97.0%甲基硫菌靈原藥對雙孢蘑菇和疣孢霉菌具有一定的抑制作用，其有效抑制中濃度分別為67.893 1、50.275 7 mg/L，其對雙孢蘑菇菌絲生長的抑制濃度高于疣孢霉菌菌絲生長的抑制濃度，對雙孢蘑菇使用較為安全。同時從田間應(yīng)用表現(xiàn)上看，試驗范圍內(nèi)，雖然70%甲基硫菌靈可濕性粉劑噴藥2 d后就出現(xiàn)輕微藥害，但6 d后70%甲基硫菌靈可濕性粉劑處理中雙孢蘑菇能恢復(fù)正常生長，新出菇也能正常生長。因此，總體可認(rèn)定在雙孢蘑菇可以安全應(yīng)用。就田間防效而言，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑速效性較好，第2次噴藥7 d后的防效可達(dá)100.0%，持效期較短，噴藥25 d后不同劑量處理的防效均有所下降，低劑量處理防效不及50%，高劑量處理防效相對較好，防效高于80%。就化學(xué)防治而言，甲基硫菌靈是防治雙孢蘑菇褐腐病的較好藥劑，建議生產(chǎn)上于病害初期施用2次0.8～1.6 g a.i./m270%甲基硫菌靈，間隔7 d。

值得注意的是，雙孢蘑菇褐腐病的防治是一個非常棘手的問題[8-10]，食用菌生長發(fā)育的環(huán)境條件很適合雜菌發(fā)生，再加上其人工栽培多在室內(nèi)，通風(fēng)差、陽光少、濕度大，而食用菌培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，又為雜菌生長和繁殖提供了優(yōu)良的物質(zhì)基礎(chǔ)[11-12]。不能單靠1種藥劑或1種方法，必須將各種措施合理地結(jié)合起來，進(jìn)行綜合防治。研究表明，在夏季對覆蓋土壤進(jìn)行日光曝曬4～5 d，在覆土7 d前，用3 kg 36%～38%化學(xué)純甲醛，兌水2～3 kg，噴灑于種植蘑菇的覆蓋土中熏蒸 48 h 以上，防病效果較理想，發(fā)病后及時挖除病菇，能防止病菌再侵染，減輕褐腐病的危害[7]。只用化學(xué)藥劑防除是不能夠滿足食用菌安全生產(chǎn)需要的，必須結(jié)合其他措施，如選育抗病品種、搞好環(huán)境衛(wèi)生、土壤消毒等，才能取得成功。