蝦過敏DNA疫苗的設(shè)計(jì)和構(gòu)建

王進(jìn)軍， 薛 藩

(揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225127)

蝦作為海產(chǎn)品的主力軍，其味道鮮美聞名于世，但不少人因?qū)ξr過敏而無法享用。目前，還沒有針對(duì)蝦過敏的治療方法。蝦過敏的主要原因是蝦中存在過敏原。隨著免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和食品生物化學(xué)等學(xué)科和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不同品種的蝦過敏原的性質(zhì)被研究，結(jié)果表明不同品種的蝦主要過敏原均為分子量36 ku組分，而且其氨基酸的組成和順序很相似，都是肌肉中的原肌球蛋白[1-2]。這種蛋白質(zhì)存在于肌原纖維中，和肌鈣蛋白一起，結(jié)合在F-肌動(dòng)蛋白上，形成細(xì)絲。進(jìn)一步研究表明，蝦過敏原的抗原表位，即能引起過敏反應(yīng)的最小單位，通常為幾個(gè)氨基酸的多肽或者肽段，如棕蝦的抗原表位為9個(gè)肽段，這9個(gè)肽段有兩大重疊區(qū)域[3-7]。

DNA疫苗即基因疫苗，是在分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第3代新型疫苗，指的是將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動(dòng)物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答?？乖蛟谝欢〞r(shí)限內(nèi)的持續(xù)表達(dá)，不斷刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使之達(dá)到防病的目的[8-9]。

本研究通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建蝦過敏原抗原表位的DNA疫苗，通過“一珠一化合物”的分析方法獲得蝦過敏抗原表位的多肽的氨基酸序列，通過真核表達(dá)載體pCI neo為骨架，加上免疫相關(guān)的因子，從而構(gòu)建完整針對(duì)刀額新對(duì)蝦過敏的DNA疫苗[10-11]，為后續(xù)的動(dòng)物試驗(yàn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，也為探索新的海產(chǎn)品，尤其蝦過敏的治療提供良好方案。

1 材料與方法

1.1 蝦過敏蛋白抗體的純化

蝦過敏蛋白主要是原肌球蛋白特異性抗體，收集蝦過敏史的患者血清，用結(jié)合重組蛋白Mete1的溴化氰活化親和層析凝膠4B(CNBr-activated Sepharose 4B，GE Healthcare，Piscataway，NJ)進(jìn)行純化獲得。

1.2 多肽鏈文庫(kù)的篩選

1.2.1 封閉 從4個(gè)(氨基酸肽鏈長(zhǎng)度分別為8、9、12、15個(gè)氨基酸)“一珠一化合物”隨機(jī)任意組合的氨基酸文庫(kù)中取 25 000～30 000珠子，裝入小層析柱。用含有0.1%吐溫-20的5%封閉液進(jìn)行封閉。

1.2.2 非特異性珠子的去除 用堿性磷酸酶耦聯(lián)的抗人的二抗(1 ∶5 000 IgG-AP或1 ∶3 000 IgE-AP)4 ℃孵育1 h，PBST洗3遍，用堿性磷酸酶反應(yīng)底物BCIP顯色，非特異性反應(yīng)的珠子會(huì)呈現(xiàn)出藍(lán)色，挑出去除，層析柱留下無色的珠子。

1.2.3 特異性珠子的初篩 用患者血清純化的抗體作為一抗(IgG為1 ∶50或 IgE為1 ∶20)4 ℃過夜孵育，PBST洗3遍，二抗用IgG-AP(1 ∶2 000)或IgE-AP(1 ∶300)4 ℃孵育1 h，PBST洗3遍，將珠子與低熔點(diǎn)瓊脂糖膠(NuSieve GTG Agarose，Cambrex Bio Science Rockland，Inc，Rockland，MN)混合后轉(zhuǎn)入平皿中，冷卻10～15 min后，加入BCIP，用平板掃描儀掃1遍。2 h后用1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，再用掃描儀掃1遍。前后2次所得的圖片通過軟件分析，比較前后2次顏色的差異。分離出顏色差異較大的珠子(即第1次掃描無顏色或淺顏色的，第2次掃描深顏色)。

1.2.4 特異性珠子的確認(rèn) 為進(jìn)一步確認(rèn)陽(yáng)性結(jié)果，將所得珠子用鹽酸胍去除顏色后按“1.2.3”節(jié)方法重復(fù)1遍，然后將含有不同多肽的珠子送至Edman公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 氨基酸序列的獲得 從測(cè)序公司獲得最終的多肽鏈的氨基酸序列。

1.3 DNA疫苗的構(gòu)建

1.3.1 DNA序列的獲得 根據(jù)“1.2.5”節(jié)獲得的氨基酸序列，按照遺傳密碼子推導(dǎo)出DNA的序列。

1.3.2 盒式片段DNA的設(shè)計(jì) 該DNA疫苗設(shè)計(jì)考慮到免疫學(xué)的需要，既要能保證正常有效地表達(dá)，又要能促進(jìn)同源抗原遞呈細(xì)胞有效地識(shí)別，并發(fā)揮TH1免疫識(shí)別效應(yīng)。在原核和真核穿梭表達(dá)載體pCIneo作為骨架，其中包含了SV40晚期poly(A)加尾信號(hào)，在此基礎(chǔ)上加入了促進(jìn)氨基酸分泌的組織型纖溶酶原激活劑(tPA信號(hào)序列)、T肽P18mn(CKRKIHIGPGQAFYT)、在T肽的兩側(cè)加上2個(gè)CpG序列(GACGTT和GAACGTCG)、泛DR輔助T細(xì)胞表位(PADRE)和有助于翻譯起始的Kozak序列[12-16]。

1.3.3 重疊PCR獲得盒式片段 根據(jù)“1.3.2”設(shè)計(jì)獲得全長(zhǎng)的氨基酸序列，根據(jù)網(wǎng)站JCAT(http：//www.jcat.de/)優(yōu)化表達(dá)的DNA序列，并檢測(cè)有無稀有密碼子。總序列長(zhǎng) 198 bp，利用重疊PCR的方法，依次設(shè)計(jì)6段60 bp左右，每段兩側(cè)各有20 bp的重疊序列，在第1個(gè)片段外側(cè)加上XhoⅠ和最后1個(gè)片段加上XbaⅠ的酶切位點(diǎn)。合成各核苷酸鏈后，按相同的濃度加入PCR運(yùn)行10循環(huán)(94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s)。然后用2個(gè)共同的引物(GCTAGCCTCGA-GGCCACCATG和GCCCGGGTCGACTCTAGA)在常規(guī)PCR條件下擴(kuò)增30循環(huán)(94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s)，獲得盒式片段全長(zhǎng)。

1.3.4 DNA疫苗的獲得 用“1.3.3”獲得的DNA片段，用XhoⅠ和XbaⅠ酶切后連接到pCIneo表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂含氨芐青霉素的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，送測(cè)序公司測(cè)序確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 “一珠一化合物”法獲得多肽

根據(jù)圖1試驗(yàn)過程，運(yùn)用“一珠一化合物”的方法進(jìn)行篩選。由表1可知，陽(yáng)性結(jié)果氨基酸測(cè)序，獲得不同長(zhǎng)度的多肽，共20個(gè)，肽鏈長(zhǎng)度為8個(gè)氨基酸的多肽4個(gè)，肽鏈長(zhǎng)度為9個(gè)氨基酸的多肽5個(gè)，肽鏈長(zhǎng)度為12個(gè)氨基酸的多肽7個(gè)，肽鏈長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸的多肽4個(gè)。

2.2 DNA疫苗關(guān)鍵盒式片段的獲得

所得20個(gè)多肽，以及相關(guān)的有助于DNA疫苗發(fā)揮更好作用的元件的氨基酸序列，到JCAT網(wǎng)站上按照表達(dá)模型偏好選擇正確的DNA序列，設(shè)計(jì)引物，用重疊PCR(圖2)后獲得完整片段(表2、圖3)。

2.3 DNA疫苗完整質(zhì)粒構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物和pCIneo質(zhì)粒分別酶切后過夜連接獲得完整的DNA疫苗質(zhì)粒，由表3、圖4可知，該疫苗質(zhì)粒包含了KOZAK序列、Th-PADRE、CpG1、Th-P18mn、CpG2、tPA信號(hào)序列、蝦抗原表位和SV40晚期poly(A)加尾信號(hào)，獲得20個(gè)蝦過敏抗原表位的DNA疫苗質(zhì)粒。

3 討論

蝦過敏蛋白主要是原肌球蛋白特異性抗體，該蛋白能引起患者的過敏反應(yīng)，常見的是皮膚反應(yīng)，如蕁麻疹和血管性水腫，也有的引起胃腸道的不適反應(yīng)，如惡心、嘔吐、腹痛和痙攣。過敏的癥狀因不同個(gè)體而有不同的差異， 一般過敏的同時(shí)，患者血清中的IgE水平也跟著升高。如果研制出蝦過敏的疫苗，很多人不會(huì)因?yàn)檫^敏而望蝦卻步。

表1 篩選所得的抗原表位氨基酸序列

DNA疫苗作為一種新型的疫苗，克服了傳統(tǒng)疫苗的成本高、安全性差、效果不理想、適用范圍不廣等不足，其關(guān)鍵是抗原表位的獲得和合適的載體。本研究采用的“一珠一化合物”化學(xué)篩選方法，特異性強(qiáng)、靈敏度高，能利用蝦過敏病人的血清純化所得的抗體，從庫(kù)中篩選出與其反應(yīng)的抗原表位多肽。

為了促進(jìn)免疫反應(yīng)的效果，在抗原表位的前后加入了KOZAK序列、Th-PADRE、CpG1、Th-P18mn、CpG2、tPA信號(hào)序列、SV40多肽加尾信號(hào)等序列，使得DNA疫苗更有效地表達(dá)[8]。KOZAK序列是在起始密碼子ATG上下游的一串DNA序列，可增強(qiáng)抗原表位多肽的翻譯效率，提高表達(dá)效率[12]。Th-PADRE為根據(jù)主要組織相容性復(fù)合物的結(jié)合特性而人工合成的，輔助T細(xì)胞表位特性的多肽，全長(zhǎng)約為13個(gè)氨基酸，有助于γ干擾素的高效分泌[16]。CpG1和CpG2作為新型佐劑的一種，屬于非特異性免疫增強(qiáng)劑，是核酸疫苗的重要組成部分，具有強(qiáng)大的免疫刺激作用，促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答[14]。Th-P18mn是T細(xì)胞輔助多肽，無主要組織相容性復(fù)合物的限制，可在小鼠體內(nèi)高效分化半抗原。組織型纖溶酶原激活劑可以促進(jìn)抗原表位多肽的分泌[15]。 SV40晚期poly(A)加尾信號(hào)，對(duì)上游的蝦過敏抗原表位的表達(dá)有一定的調(diào)控作用[17]。

表2 盒式片段完整序列

表3 盒式片段重疊PCR所用引物

選用的pCI neo載體屬于真核表達(dá)載體，有助于將蝦過敏的抗原表位多肽在小鼠的動(dòng)物模型中高效地表達(dá)[18]。該DNA疫苗的成功構(gòu)建，為下一步動(dòng)物試驗(yàn)提供了很好的試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為蝦過敏的治療提供了一種新的方法。