高效液相色譜法同時測定水果中7種合成色素

劉佩，于文江，鄭紅

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250103）

食用色素能夠改善食品色澤，是食品添加劑的一個重要組成部分，在食品加工業(yè)中具有十分重要的地位。按其來源和性質(zhì)，食用色素分為天然色素和合成色素，天然色素安全對環(huán)境無污染[1]，但穩(wěn)定性較差。合成色素價格便宜、著色力強、穩(wěn)定性好，目前在食品加工方面應(yīng)用廣泛，但是合成色素大多屬于偶氮類化合物，對人體健康存在一定的不安全性。我國允許在食品中添加的合成色素有莧菜紅、胭脂紅、檸檬黃、新紅、赤蘚紅、日落黃、亮藍、酸性紅、喹啉黃、靛藍及其鋁色淀。而根據(jù)我國GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[2]規(guī)定，它們禁止用于新鮮水果。

目前，食品中人工合成色素的檢測方法主要有高效液相色譜法[3-7]、紫外分光光度法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8,9]、毛細管電泳法[10]、極譜法[11]和薄層色譜法等。由于水果本身含有大量的天然色素，建立一種針對水果中多種人工合成色素同時檢測的方法是十分必要的。文章對水果中易添加的檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅7種人工合成色素的測定方法進行了研究，建立了同時檢測水果中違規(guī)添加的7種人工合成色素的高效液相色譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅（純度>99.5%），國家標準物質(zhì)研究中心。甲醇（色譜純），德國Merck公司。醋酸銨（分析純），上海國藥集團。Waters 2695高效液相色譜儀，包括在線真空脫氣機、四元高壓梯度泵、自動進樣器、恒溫柱溫箱、二極管陣列檢測器，美國沃特世公司；MS204S電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG-9075A電熱鼓風干燥箱，上海和羽良電子科技有限公司；Milli-Q IQ7000型超純水機，美國Millipore公司；SB-800 DTD超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取粉碎過的新鮮水果樣品5g至25mL比色管中，加入20mmol/L醋酸銨水溶液15mL，超聲提取15min，用20mmol/L醋酸銨水溶液定容至刻度，混合搖勻，經(jīng)過0.45μm濾膜過濾，待測。

1.2.2 標準溶液的配制

準確稱取檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅各50.0mg，加超純水溶解并定容至50mL，此標準溶液濃度為1.0mg/mL。將上述標準溶液進行稀釋，配制成 5、10、20、40、80、100μg/mL 的混合標準工作溶液。

1.2.3 色譜條件

流動相：A-20mmol/L醋酸銨溶液，B-甲醇。流速：0.8mL/min。色譜柱：C18（3.5μm，4.6mm×150mm），柱溫：35℃，檢測波長：254nm，進樣量：10μL，梯度洗脫。

1.2.4 定性定量測定

將經(jīng)過前處理的水果樣品，進樣經(jīng)HPLC分析。采用標準物質(zhì)的保留時間和目標物光譜圖對樣品峰進行定性，采用外標法以峰面積計算定量。濃度的檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅使用7種合成色素混合標準溶液進樣分析，以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算出樣品中各種色素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相選擇及優(yōu)化

目前高效液相色譜檢測流動相主要是甲醇和乙腈，試驗分別考察了甲醇-甲酸銨、乙腈-甲酸銨、甲醇-醋酸銨、乙腈-醋酸銨4種流動相體系對7種色素的分離效果。綜合考慮分離度、樣品的分析時間和目標組分峰形，選用甲醇-醋酸銨為流動相，梯度洗脫程序見表1。分離后的標準物質(zhì)色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for mobile phase

圖1 標準物質(zhì)色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard substance

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍和檢出限

在優(yōu)化好的試驗條件下，繪制標準曲線，以基線噪聲10倍峰面積對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限，線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量限見表2。由表2可以看出，在0～100μg/mL的濃度范圍內(nèi)，7種合成色素的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

表2 7種合成色素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及定量限Table 2 Linear range,regression equation,correlation coefficient and quantitative limit of 7 synthetic pigments

2.2.2 精密度實驗

取一空白水果樣品加標（0.10mg/kg），重復(fù)進樣6次，計算出精密度，7種合成色素的相對標準偏差（RSD）為2.8%～3.6%，精密度良好。

2.2.3 加標回收率實驗

在空白水果樣品中，各色素添加水平均為0.050mg/kg、0.20mg/kg，按優(yōu)化好的樣品處理方法處理，每個濃度做6個平行，加標回收率為95.8%～103.9%。

3 結(jié)論

通過試驗建立了水果中檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅7種人工合成色素的高效液相色譜檢測方法。方法加標回收率95.8%～103.9%，相對標準偏差 2.8%～3.6%（n=6），檢出限為 0.015～0.025mg/kg。方法的測定快速準確，適用于水果中多種人工合成色素的同時檢測。