不同價(jià)態(tài)鉻離子對煙草幼苗抗氧化關(guān)鍵酶和根系活力的影響

趙明香 張琦 趙德國 向蓉蓉 朱永立 保志娟

摘要：【目的】探討不同價(jià)態(tài)鉻離子對煙草幼苗生長發(fā)育的影響，為鉻污染下煙草的耐性機(jī)制研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳栽茻?7和紅花大金元為試驗(yàn)材料，采用水培試驗(yàn)法研究不同質(zhì)量濃度（0.1、0.5、1.0和5.0 mg/L）Cr3+和Cr6+對煙草幼苗相關(guān)抗氧化指標(biāo)的影響，分別測定不同時(shí)間（15和30 d）下鉻脅迫處理和對照（未添加鉻離子處理）幼苗葉片的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性、丙二醛（MDA）和脯氨酸（pro）含量及根系活力?！窘Y(jié)果】Cr3+處理15 d時(shí)，云煙87的POD和PPO活性及紅花大金元的SOD活性隨著鉻離子濃度的增加而升高;Cr3+脅迫30 d及Cr6+分別脅迫15和30 d時(shí)，兩個(gè)煙草品種幼苗葉片的SOD、POD和PPO活性均隨著鉻離子濃度的增大整體呈先升高后降低的變化趨勢，兩個(gè)品種幼苗葉片酶活性最大時(shí)Cr3+濃度為0.5～1.0 mg/L、Cr6+濃度為0.5 mg/L，且鉻脅迫對云煙87酶活性的抑制作用總體上強(qiáng)于紅花大金元。隨著鉻離子濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長，煙草幼苗體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用加劇，MDA和pro積累量逐漸增加，高濃度鉻離子脅迫下煙苗根系活力較對照顯著降低（P<0.05）?！窘Y(jié)論】在水培條件下，Cr6+對煙苗抗氧化系統(tǒng)的損傷大于Cr3+;與云煙87相比，紅花大金元表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鉻性。

關(guān)鍵詞： 不同價(jià)態(tài)鉻;煙草;抗氧化關(guān)鍵酶;根系活力

中圖分類號： S572.01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）11-2155-07

Effects of chromium ions with different valences on antioxidant key enzymes and root activity of tobacco seedlings

ZHAO Ming-xiang， ZHANG Qi， ZHAO De-guo， XIANG Rong-rong，

ZHU Yong-li， BAO Zhi-juan*

（College of Tobacco Science， Yunnan Agricultural University， Kunming? ?650201， China）

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for the dissection of tolerance mechanism of tobacco under chromium pollution， the influence of chromium ions with different valences on the growth and development of tobacco seedlings was studied. 【Method】Yunyan 87 and Honghuadajinyuan were used as tested tobacco materials. The effects of Cr3+ and Cr6+ with different concentrations（0.1，0.5，1.0 and 5.0 mg/L） on related antioxidant indexes of tobacco seedlings were investigated by using solution culture. The activities of superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD） and polyphenol oxidase（PPO）， contents of malondialdehyde（MDA） and proline（Pro） in leaves， and root activity of seedlings which were treated with chromium stress and control（without adding chromium ions） were determined at va-rious time points after culturing（15 and 30 d）. 【Result】At 15 d after Cr3 treatment， the POD and PPO activities of Yunyan 87 and SOD activity of Honghuadajinyuan increased with the increase of chromium ions concentration. The activities of SOD， POD and PPO in the seedlings leaves of two tobacco varieties generally increased first and then decreased with the increase of chromium ions concentration when they were treated by Cr3+ stress at 30 d and Cr6+ stress at 15 and 30 d. And under the highest value of enzyme activity of seedlings leaves of the two tobacco varieties， the concentrations of Cr3+ and Cr6+were 0.5-1.0 mg/L and 0.5 mg/L respectively. The inhibitory effect of chromium stress on enzyme activity of Yunyan 87 were? stronger than that on Honghuadajinyuan. With the increase of chromium ions concentration and the extension of stress time， the lipid peroxidation was aggravated in tobacco seedlings， the accumulation of MDA and Pro increased gra-dually， and root activity of tobacco seedlings under high concentration of chromium ion stress significantly decreased compared with that of control（P<0.05）. 【Conclusion】In solution culture， Cr6+ has greater damage to the antioxidant system of tobacco seedlings than Cr3+. Honghuadajinyuan shows stronger resistance to chromium than Yunyan 87.

Key words： chromium with different valences;tobacco;antioxidant key enzyme;root activity

0 引言

【研究意義】鉻作為工業(yè) “五毒”之一，是一種毒性較大的致畸、致突變劑（顧公望和張宏偉，1993），也是地下水、土壤和沉積物中第二常見的金屬污染物（Singh et al.，2013）。目前，土壤鉻污染、農(nóng)產(chǎn)品鉻超標(biāo)及其安全性問題已受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。煙草是易富集鉻的植物，重金屬鉻會(huì)影響煙株生長發(fā)育，最終影響煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，進(jìn)而降低煙草的利用價(jià)值（趙明香和保志娟，2018）。重金屬的生物毒性不僅與其總量有關(guān)，更大程度上由其形態(tài)分布所決定。不同形態(tài)產(chǎn)生不同的環(huán)境效應(yīng)，直接影響到重金屬的毒性、遷移及其在自然界的循環(huán)。鉻在土壤中主要以Cr6+和Cr3+兩種價(jià)態(tài)存在，不同價(jià)態(tài)鉻的毒性、毒理及生態(tài)效應(yīng)均不同（貢曉飛等，2015）。因此，探討不同價(jià)態(tài)鉻脅迫對煙草幼苗生理特性的影響，對研究鉻污染下煙草的耐性機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】通常認(rèn)為，Cr6+對生物具有較大毒性（Sharma et al.，2003）。有研究表明，Cr6+脅迫能顯著降低植株的生物量、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒夂凸夂蠀?shù)，增加丙二醛（MDA）的積累，造成植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷（石貴玉和陳明媚，2005;曾淑華等，2014;Bukhari et al.，2016）。當(dāng)煙苗受到一定濃度Cr6+脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)可啟動(dòng)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等保護(hù)酶系統(tǒng)，通過提高酶活性來清除體內(nèi)過多的活性氧，進(jìn)一步減緩煙株受傷害程度，但Cr6+超過一定濃度，抗氧化酶活性顯著被抑制，煙苗生理活動(dòng)受限，抑制其生長發(fā)育（Zamocky and Koller，1999;宋威等，2011）。此外，朱四喜等（2014）、王琪和容麗（2015）研究發(fā)現(xiàn)，高濃度鉻對植物根系的生物量和根系活力具有抑制作用，會(huì)影響根系發(fā)育。Cr3+是人體必需的營養(yǎng)元素，但對植物是否有類似作用尚無定論（陳永林等，2017）。李建文和黃堅(jiān)（2006）研究發(fā)現(xiàn)，不同價(jià)態(tài)鉻對水生生物的毒性影響結(jié)果不一致。梁艷茹等（2010）研究表明，Cr3+對土壤堿性磷酸酶活性的抑制作用明顯強(qiáng)于Cr6+。因此，無論是Cr6+還是Cr3+，其潛在危險(xiǎn)均十分明顯?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，國內(nèi)外學(xué)者對鉻脅迫下的植物生理開展了大量研究（徐勤松等，2002;陳耕云等，2006;Budhari et al.，2016），但鮮見不同價(jià)態(tài)鉻對水培煙苗生長發(fā)育影響方面的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用水培試驗(yàn)方法，研究不同價(jià)態(tài)鉻（Cr6+和Cr3+）脅迫對不同品種煙草幼苗抗氧化關(guān)鍵酶活性和根系活力的影響，旨在探討不同價(jià)態(tài)鉻離子對煙草生長發(fā)育的影響，以期為鉻污染下煙草的耐性機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為云煙87和紅花大金元，種子來源于玉溪中煙種子有限責(zé)任公司。供試硝酸鉻、重鉻酸鉀、氫氧化鈉、鹽酸等化學(xué)試劑均為分析純，購自西隴化工股份有限公司和天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2017年7—12月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院日光溫室中進(jìn)行。采用漂浮育苗方法培育煙苗，待煙苗長至貓耳期時(shí)，選擇長勢較一致的幼苗移植到盛有Hoagland營養(yǎng)液（用0.1 mol/L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH為6.0）的500 mL水培罐中，并用錫箔紙包裹使根部避光以促進(jìn)根系生長，每天通氣2 h，每3 d更換1次營養(yǎng)液（包括測定指標(biāo)時(shí)間）。預(yù)培養(yǎng)7 d后，向營養(yǎng)液中加入Cr3+和Cr6+溶液，使?fàn)I養(yǎng)液中Cr3+和Cr6+最終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0和5.0 mg/L（Cr3+和Cr6+分別由硝酸鉻和重鉻酸鉀提供），以不添加Cr3+和Cr6+的營養(yǎng)液（0 mg/L）為對照。3次重復(fù)，每罐植煙3株，每處理共植煙9株，分別在處理的第15和30 d時(shí)取樣測定相關(guān)生理指標(biāo)。

1. 3 測定指標(biāo)及方法

在煙苗生長第15和30 d時(shí)，用打孔器取4～6葉位（從根部往上數(shù)）的一定質(zhì)量（2 g）煙葉，立即放入液氮中保存，隨后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑法，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，多酚氧化酶（PPO）活性測定采用鄰苯二酚法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法（閔強(qiáng)等，2016），脯氨酸（Pro）含量測定采用磺基水楊酸法（王學(xué)奎和黃見良，2015），根系活力（第30 d）測定采用甲烯藍(lán)法（陳綺翎等，2016）。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 19.0進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2017制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同價(jià)態(tài)鉻離子對煙草幼苗SOD活性的影響

由圖1可看出，Cr3+和Cr6+分別處理15和30 d時(shí)，云煙87幼苗的SOD活性變化相似，當(dāng)鉻離子濃度為0～0.5 mg/L時(shí)， SOD活性隨鉻離子濃度的增加而增加;當(dāng)鉻離子濃度為0.5～1.0 mg/L時(shí)，SOD活性隨鉻離子濃度的增加明顯下降;當(dāng)鉻離子濃度繼續(xù)增加，SOD活性在平穩(wěn)中略呈下降趨勢。對于紅花大金元，Cr3+和Cr6+處理15 d時(shí)，SOD活性隨鉻離子濃度的增加而升高;Cr3+和Cr6+處理30 d時(shí)，SOD活性表現(xiàn)為低促高抑，鉻離子濃度大于0.5 mg/L時(shí)煙苗SOD活性受到抑制。兩個(gè)品種幼苗的SOD活性均隨處理天數(shù)的增加而降低，且高濃度下Cr3+處理的SOD活性高于Cr6+。

2. 2 不同價(jià)態(tài)鉻離子對煙草幼苗POD活性的影響

由圖2可看出，云煙87幼苗受Cr3+脅迫15和30 d時(shí)，其POD活性隨Cr3+濃度的增加而升高，且均高于對照，其中0.5～5.0 mg/L處理與對照差異顯著（P<0.05，下同）;受Cr6+脅迫15和30 d時(shí)，隨鉻離子濃度增加，POD活性呈先升高后降低的變化趨勢，均為0.5 mg/L處理POD活性最高，其中不同濃度Cr6+處理的POD活性在脅迫15 d時(shí)均顯著高于對照，而脅迫30 d時(shí)則較對照顯著下降。對于紅花大金元，隨著Cr3+和Cr6+濃度的增加，其幼苗POD活性也呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，POD活性達(dá)最高值的Cr3+和Cr6+濃度分別為1.0和0.5 mg/L;不同濃度Cr3+脅迫15和30 d及Cr6+脅迫15 d的POD活性均顯著高于對照，而Cr6+脅迫30 d的POD活性則顯著低于對照。兩個(gè)品種的表現(xiàn)均表明Cr6+的毒性具有時(shí)間累積性，在鉻的價(jià)態(tài)、濃度和脅迫時(shí)間相同時(shí)，紅花大金元幼苗的POD活性高于云煙87。

2. 3 不同價(jià)態(tài)鉻離子對煙草幼苗PPO活性的影響

由表1可看出，不同濃度Cr3+脅迫15 d時(shí)，云煙87幼苗的PPO活性均顯著高于對照，但鉻離子濃度增加對PPO活性的影響不明顯，0.1～5.0 mg/L處理間差異不顯著（P>0.05）;而紅花大金元幼苗的PPO活性則先升高后降低，其中1.0 mg/L處理的PPO活性最高。Cr3+脅迫30 d和Cr6+脅迫15 d時(shí)，兩個(gè)品種幼苗的PPO活性均隨鉻離子濃度的增加呈先升高后降低的變化趨勢，PPO活性最高時(shí)的Cr3+和Cr6+濃度分別為1.0和0.5 mg/L。Cr6+處理30 d時(shí)，兩個(gè)品種均為0.1 mg/L處理的葉片PPO活性最高，分別比對照增加51.93%和47.70%，之后PPO活性隨Cr6+濃度的增加而降低?？傮w來看，Cr3+對煙苗的PPO活性有一定促進(jìn)作用;Cr6+在短期內(nèi)可增加煙苗的PPO活性，但隨著脅迫時(shí)間延長，高濃度Cr6+則抑制PPO活性;相同條件下，紅花大金元的PPO活性高于云煙87。

2. 4 不同價(jià)態(tài)鉻離子對煙草幼苗MDA含量的影響

由圖3可看出，在Cr3+和Cr6+脅迫下，隨鉻離子濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長，兩個(gè)品種幼苗葉片內(nèi)的MDA含量均逐漸積累，且高濃度鉻離子處理（1.0和5.0 mg/L）均與對照差異顯著?？傮w來看，鉻的價(jià)態(tài)和濃度相同時(shí)，脅迫30 d處理煙苗內(nèi)的MDA含量高于脅迫15 d的處理;鉻離子濃度和脅迫天數(shù)相同時(shí)，Cr6+處理煙苗的MDA含量高于Cr3+處理的煙苗;相同條件下，云煙87的MDA含量高于紅花大金元。

2. 5 不同價(jià)態(tài)鉻離子對煙草幼苗Pro含量的影響

由表2可看出，隨鉻離子濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長，兩個(gè)品種幼苗葉片內(nèi)的Pro含量均呈逐漸增加趨勢?？傮w來看，鉻離子濃度和脅迫天數(shù)相同時(shí)，Cr6+比Cr3+處理煙苗葉片內(nèi)Pro含量高;Cr3+和Cr6+處理15 d時(shí)，云煙87幼苗葉片內(nèi)的Pro含量高于紅花大金元，而處理30 d時(shí)，紅花大金元幼苗葉片內(nèi)的Pro含量高于云煙87。

2. 6 不同價(jià)態(tài)鉻離子對煙草幼苗根系活力的影響

從表3可看出，鉻離子濃度對云煙87根系活力產(chǎn)生低促高抑作用，根系活力最大時(shí)的Cr3+和Cr6+濃度分別為0.5和0.1 mg/L，比對照提高9.46%和4.19%。在Cr3+和Cr6+脅迫下，紅花大金元的根系活力隨鉻離子濃度增加呈先增加后降低的變化趨勢，根系活力最大時(shí)的Cr3+和Cr6+濃度均為1.0 mg/L，其中Cr3+處理下根系活力比對照提高1.33%，Cr6+處理下根系活力低于對照。在0.1～0.5 mg/L處理下，云煙87根系活力高于紅花大金元;在1.0 mg/L處理下，紅花大金元根系活力高于云煙87。

3 討論

SOD、POD和PPO是植物應(yīng)對膜脂過氧化作用的酶促防御系統(tǒng)中的重要保護(hù)酶，與植物抗逆性密切相關(guān)。通常認(rèn)為，低濃度的重金屬脅迫對煙草生長有利，而高濃度則會(huì)對煙草生長產(chǎn)生抑制作用（張艷玲和周漢平，2004;宋威等，2011）。本研究中，低濃度Cr6+脅迫使兩個(gè)品種煙苗的抗氧化酶活性增加，而高濃度Cr6+脅迫使煙苗的抗氧化酶活性降低，清除自由基能力下降，與Davies等（2002）、王愛云等（2012）的研究結(jié)果相一致。Cr3+雖然是人體和動(dòng)物的營養(yǎng)元素，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)高濃度的Cr3+會(huì)對油菜、小麥和玉米產(chǎn)生毒害（Kleiman and Cogliatti，1998;陳永林等，2017）。本研究結(jié)果表明，短期脅迫時(shí)Cr3+能增加云煙87和紅花大金元的抗氧化酶活性，但隨著脅迫時(shí)間的延長，Cr3+對兩個(gè)品種煙苗葉片的抗氧化酶活性和根系活力均產(chǎn)生低促高抑的作用，表明高濃度的Cr3+也會(huì)使膜脂發(fā)生氧化，膜透性增加，抗性減弱，對煙苗造成損傷。此外，本研究發(fā)現(xiàn)Cr6+對煙苗抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響整體大于Cr3+，原因可能是培養(yǎng)液中的六價(jià)鉻由K2Cr2O7提供，具有較強(qiáng)的氧化性，容易破壞植物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對根細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，阻礙了植物吸收營養(yǎng)成分，并最終影響植物的生長發(fā)育（貢曉飛等，2015）。另外，Cr6+毒性雖然大于Cr3+，但與陳永林等（2017）報(bào)道的Cr6+是Cr3+的100倍生物毒性的研究結(jié)果存在較大差異。Cr6+在水體中以CrO42-、Cr2O72-和HCrO4- 3種陰離子形式存在，當(dāng)pH改變時(shí)，六價(jià)鉻陰離子的主要存在形式也不同。植物根系容易吸收CrO42-形式，這種化學(xué)形態(tài)易于穿過細(xì)胞壁深入到細(xì)胞質(zhì)中，影響蛋白組織和抗氧化酶的形成（Duman and Koca，2014）。在本研究條件下，水培營養(yǎng)液pH為6.0，此時(shí)Cr6+主要以HCrO4-形式為主，因而降低了植物根對Cr6+的吸收，使Cr6+毒性表現(xiàn)減弱。

重金屬脅迫下，植物體內(nèi)的氧化還原平衡容易被打破，積累的過氧化物使膜脂發(fā)生氧化作用，并使膜脂過氧化的標(biāo)志物MDA含量增加（陳耕云等，2006;石貴玉等，2007;李覓等，2008;Maksymiec，2011）。本研究結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了該觀點(diǎn)，在Cr3+和Cr6+脅迫下，煙苗的MDA含量隨鉻離子濃度的增加而顯著增加，且處理30 d高于15 d，表明兩個(gè)價(jià)態(tài)的鉻脅迫均會(huì)使煙苗體內(nèi)膜脂過氧化作用增強(qiáng)，并且在高濃度鉻和脅迫時(shí)間延長的情況下導(dǎo)致細(xì)胞膜受損加劇。

Pro可保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)，維持胞內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)，減少胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解，且抗性越強(qiáng)的品種中游離Pro的含量越高（俞慧娜等，2005;王學(xué)奎和黃見良，2015）。本研究中，兩個(gè)品種煙苗體內(nèi)的Pro含量均隨鉻離子濃度的增加而增加。在高濃度鉻長時(shí)間脅迫下，紅花大金元的游離Pro含量明顯高于云煙87，且紅花大金元的抗氧化指標(biāo)表現(xiàn)相對較優(yōu)，這可能是該品種擁有一個(gè)或幾個(gè)對鉻表現(xiàn)出較強(qiáng)抗性的基因所致。因此，今后的研究應(yīng)從基因方面入手，篩選出紅花大金元的抗鉻基因，為抗重金屬煙草品種選育及鉻污染下煙草的耐性機(jī)制研究提供依據(jù)。

4 結(jié)論

不同價(jià)態(tài)鉻脅迫下，隨著鉻離子濃度增加，不同煙草品種幼苗葉片內(nèi)的SOD、POD和PPO活性及煙苗根系活力整體呈先增加后降低的變化趨勢，在分別處理15和13 d時(shí)，兩個(gè)品種幼苗葉片酶活性最大時(shí)Cr3+濃度為0.5～1.0 mg/L、Cr6+濃度為0.5 mg/L。Cr3+和Cr6+脅迫可對煙草幼苗葉片膜脂系統(tǒng)造成氧化損傷，隨鉻離子濃度的增加，MDA和Pro積累量逐漸增加?？傮w來看，煙草幼苗各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)對鉻離子脅迫存在時(shí)間反應(yīng)性和積累性，Cr6+對煙草幼苗的毒害作用大于Cr3+，紅花大金元較云煙87表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鉻性。

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