苗藥黑骨藤多指標(biāo)的含量測定及聚類分析

劉育辰 劉麗蘋 劉剛 金文淵 龍毅 黃明喆 楊欣

中圖分類號 R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）12-1636-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.12

摘 要 目的：建立同時測定苗藥黑骨藤中綠原酸和杠柳毒苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Xtimate C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件根據(jù)藥材樣品中綠原酸和杠柳毒苷的含量進(jìn)行聚類分析。結(jié)果：綠原酸、杠柳毒苷檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.040 6～1.8 μg（r=0.999 4）、0.016 8～2.3 μg（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于5.0%；定量限分別為0.918 0、0.084 3 μg/mL，檢測限分別為0.102 0、0.025 3 μg/mL；加樣回收率分別為102.66%～104.00%（RSD=0.53%，n=6）、96.44%～100.79%（RSD=1.73%，n=6）；耐用性試驗的RSD均小于3.0%。18份藥材樣品可聚為三大類，即S2、S4、S10、S12、S14～S18聚為一類，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚為一類，S8為一類。結(jié)論：該方法可用于黑骨藤藥材的質(zhì)量控制和品質(zhì)評價；不同產(chǎn)地黑骨藤藥材中綠原酸和杠柳毒苷的含量有較大差異，各成分含量與產(chǎn)地有一定關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞 黑骨藤；綠原酸；杠柳毒苷；含量測定；聚類分析

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for content determination of chlorogenic acid and periplocin in Miao medicine Periploca forrestii. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Xtimate C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 220 nm， and column temperature was maintained at 25 ℃. The sample size was 10 μL. Cluster analysis was conducted according to the content of chlorogenic acid and periplocin in samples by SPSS 23.0 software. RESULTS： The linear range of chlorogenic acid and periplocin were 0.040 6-1.8 μg（r=0.999 4） and 0.016 8-2.3 μg（r=0.999 9）， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all lower than 5.0%. The quantitation limits were 0.918 0， 0.084 3 μg/mL， and detection limits were 0.102 0， 0.025 3 μg/mL， respectively. RSD of durability were lower than 3.0%. The recoveries were 102.66%-104.00%（RSD=0.53%，n=6）， 96.44%-100.79%（RSD=1.73%，n=6），respectively. RSD of durability were lower than 3.0%. The result indicated that 18 batches of samples were divided into 3 categories by cluster analysis. S2， S4， S10， S12 and S14-S18 were divided into one category； S1， S3， S5-S7， S9， S11 and S13 were divided into another category； S8 was regarded as one category. CONCLUSIONS： The method can be applied for quality control and evaluation of P. forrestii. The contents of chlorogenic acid and periplocin in P. forrestii from different producing areas are different greatly. There is a certain correlation between the content of each component and the producing area.

KEYWORDS Periploca forrestii； Chtorogenic acid； Periplocin； Content determination； Cluster

黑骨藤為蘿藦科（Asclepiadaceae）杠柳屬（Periploca）植物黑龍骨（Periploca forrestii Schltr.）的干燥根或全株，又名飛仙藤、黑骨頭、柳葉過山龍、滇杠柳等，苗語稱嘎八又賒、銳松怪、蛙蟒塞，其味苦，辛、溫，有小毒，具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)之功效，多用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、乳腺炎、閉經(jīng)等病癥。主要分布在貴州、云南、廣西、西藏等地，生長于2 500米以下山地疏林向陽處、陰濕雜木林下及灌木叢中[1-2]。

黑骨藤藥材通常為野生，無規(guī)范種植基地，藥材質(zhì)量難以控制，目前仍執(zhí)行的是2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[3]，此標(biāo)準(zhǔn)中只有來源、性狀、顯微鑒別和理化鑒別等傳統(tǒng)項目。研究發(fā)現(xiàn)，黑骨藤藥材含有黃酮類[4]、香豆素類[5]、強(qiáng)心苷類[6]、三萜類[6]、酚酸類[7]、C21甾類[4]、神經(jīng)酰胺類[8]等多種成分，但目前其含量測定主要集中于總皂苷[9]、總黃酮[10]、黃酮苷[11]、強(qiáng)心苷[12]等單一指標(biāo)。藥理實驗證明，黑骨藤藥材中咖啡?；鼘幩犷惓煞趾偷岣芰疹惓煞址謩e具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[13]和強(qiáng)心作用[14]。因此，本研究以上述兩類活性成分的代表綠原酸和杠柳毒苷作為質(zhì)量控制指標(biāo)，采用高效液相色譜法（HPLC）對貴州省不同產(chǎn)地的黑骨藤藥材中兩種成分的含量進(jìn)行測定，并進(jìn)行聚類分析，以便更全面地評價其質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate-3000 型HPLC儀，包括自動進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱、二級管陣列檢測器和Chromeleon 色譜工作站[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；DRHH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實驗設(shè)備有限公司）；Q-2508型高速多功能粉碎機(jī)（上海冰都電器有限公司）；JT1003型電子分析天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）。

1.2 試劑

綠原酸對照品（批號：MUST-16031610，純度：>98%）、杠柳毒苷對照品（批號：MUST-16072202，純度：>98%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

18份藥材樣品采自貴州省不同產(chǎn)地（見表1），經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院劉剛實驗師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Xtimate C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min，9%→10% A；12～30 min，10%→21% A；30～50 min，21%→35% A；50～60 min，35%→70% A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取綠原酸對照品5.08 mg，置于5 mL量瓶中，以流動相溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.016 mg/mL的綠原酸對照品溶液；精密稱取杠柳毒苷對照品8.40 mg，置于10 mL量瓶中，以流動相溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.840 mg/mL的杠柳毒苷對照品溶液。再精密量取上述綠原酸對照品溶液2 mL、杠柳毒苷對照品溶液1 mL，置于同一50 mL量瓶中，加流動相定容，搖勻，制成綠原酸、杠柳毒苷質(zhì)量濃度分別為0.040 6、0.016 8 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品粉末2.0 g，按料液比1 ∶ 25加入70%乙醇溶液50 mL，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，于70 ℃水浴蒸干，加25 mL水使成混懸液，分別依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取3次，將3次正丁醇萃取液合并，濃縮至干，殘渣用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移并定容至10 mL量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)按綠原酸、杠柳毒苷峰計應(yīng)大于5 000；保留時間分別為17.2、46.0 min，表明基線分離良好。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、5、10、14、20、25 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得綠原酸、杠柳毒苷回歸方程分別為y=36.258x-0.765 8（r=0.999 4）、y=19.240x-0.269 5（r=0.999 9）。結(jié)果表明，綠原酸、杠柳毒苷檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.040 6～1.8、0.016 8～2.3 μg。

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷定量限分別為0.918 0、0.084 3 μg/mL，檢測限分別為0.102 0、0.025 3 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷峰面積的RSD分別為0.16%、1.64%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S1）8份，分別于室溫下放置1、3、5、9、12、15、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷峰面積的RSD分別為4.15%、1.34%（n=8），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取藥材樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷含量平均值分別為0.230 8、0.062 2 mg/g，RSD分別為 4.17%、2.41%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量藥材樣品（編號：S1）6份，每份1 g，分別加入綠原酸、杠柳毒苷對照品溶液各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 耐用性試驗

2.10.1 流速考察 精密稱取藥材樣品（編號：S2）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液1份，再按“2.1”項下色譜條件（流速分別為0.8、1.0、1.2 mL/min）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷含量平均值分別為0.232 4、0.062 1 mg/g，RSD分別為2.54%、1.70%，表明流速一定程度波動能滿足試驗要求，本方法耐用性良好。

2.10.2 柱溫考察 精密稱取藥材樣品（編號：S2）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液1份，再按“2.1”項下色譜條件（柱溫分別為25、30、35 ℃）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷含量平均值分別為0.231 5、0.061 0 mg/g，RSD分別為0.90%、2.70%，表明柱溫一定程度波動能滿足試驗要求，本方法耐用性良好。

2.11 樣品含量測定

取18份藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表3。

2.12 聚類分析

以各共有峰相對峰面積為變量，采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對藥材樣品進(jìn)行聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以夾角余弦作為樣品相似度的距離公式，結(jié)果見圖2。由圖2可見，聚類譜系中，將18份藥材樣品聚為三大類：即S2、S4、S10、S12、S14～S18聚為一類，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚為一類，S8為一類。

3 討論

由表3可知，藥材樣品中綠原酸含量為0.047 1～0.376 0 mg/g，貴陽市烏當(dāng)區(qū)相思河產(chǎn)藥材樣品中綠原酸含量最低，安順市產(chǎn)藥材樣品中綠原酸含量最高；杠柳毒苷含量為0.016 1～0.485 2 mg/g，貴陽市烏當(dāng)區(qū)相思河產(chǎn)藥材樣品中杠柳毒苷含量最低，安順市產(chǎn)藥材樣品中杠柳毒苷含量最高。從各地區(qū)藥材樣品2種成分含量上來看，綠原酸和杠柳毒苷含量似有所關(guān)聯(lián)，即貴陽市烏當(dāng)區(qū)相思河產(chǎn)藥材樣品上述2種成分含量均最低，而安順市產(chǎn)藥材樣品上述2種成分含量均最高，綠原酸含量兩產(chǎn)地藥材樣品相差約8倍，杠柳毒苷含量兩產(chǎn)地藥材樣品相差約30倍。筆者采樣過程中發(fā)現(xiàn)，黑骨藤藥材生長對周圍生態(tài)環(huán)境的選擇性非常強(qiáng)，它喜歡生長在向陰、水分充足的密林中。而安順市藥材產(chǎn)地環(huán)境恰恰符合上述特點。

聚類分析結(jié)果表明，綠原酸和杠柳毒苷含量與黑骨藤藥材的產(chǎn)地具有一定的聯(lián)系。18份藥材樣品主要聚為三大類，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚為一類，它們所處地理位置均在貴陽市以北區(qū)域；S2、S4、S10、S12、S14～S18聚為一類，它們所處地理位置基本在貴陽市以南區(qū)域；而自成一類的S8，其所處地理位置也在貴陽市以南區(qū)域。

綜上所述，本方法可用于黑骨藤藥材的質(zhì)量控制和品質(zhì)評價；不同產(chǎn)地黑骨藤藥材中綠原酸和杠柳毒苷的含量有較大差異，各成分含量與產(chǎn)地有一定關(guān)聯(lián)。本結(jié)論為該藥材最佳產(chǎn)地的確定奠定了一定基礎(chǔ)，有助于指導(dǎo)藥材種植及采收。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 邱德文，杜江. 中華本草：苗藥卷[M].貴陽：貴州科技出版社，2005：526-527.

[ 2 ] 邱德文，杜江. 貴州十大苗藥研究[M].北京：中國古籍出版社，2008：261-324.

[ 3 ] 貴州省藥品監(jiān)督管理局. 貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M]. 2003年版.貴陽：貴州科技出版社，2003：381.

[ 4 ] 張嫩玲，劉香，沈春祥，等. 黑龍骨的化學(xué)成分[J].中藥材，2016，39（2）：329-330.

[ 5 ] 李勇，劉云寶，庾石山. 黑龍骨化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2013，38（10）：1536-1538.

[ 6 ] 徐冉，杜娟，鄧璐璐，等. 滇杠柳中的一個新強(qiáng)心苷[J].中國中藥雜志，2012，37（15）：2286-2288.

[ 7 ] 趙珊，張寶，熊丹丹，等.苗藥黑骨藤化學(xué)成分的研究[J].中草藥，2017，48（8）：1513-1518.

[ 8 ] 趙超，甘秀海，龔小見，等. 黑骨藤中神經(jīng)酰胺類化學(xué)成分[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（23）：83-85.

[ 9 ] 申海艷，龔小見，李文敏，等. 苗藥黑骨藤中總皂苷含量的測定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（11）：94-97.

[10] 景小楠， 鐘菡， 張宏，等. 黑骨藤中總黃酮含量的測定[J].四川師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，33（1）：89- 92.

[11] 陳華國，周欣，曹桂紅，等. HPLC測定黑骨藤中槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷含量[J].中國中藥雜志，2010，35（10）：1284-1286.

[12] 劉育辰，劉剛，張樹芬，等. 苗藥黑骨藤部分理化指標(biāo)及杠柳毒苷含量的測定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：130-132.

[13] 王霞，楊健，宋菲，等. 苗藥黑骨藤中咖啡酰基奎寧酸類部位對人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞MH7A增殖及炎癥因子分泌的影響[J].中國藥房，2017，28（28）：3949-3952.

[14] 鄧士賢，王德成，王懋德，等. 滇杠柳苷的強(qiáng)心作用[J].藥學(xué)學(xué)報，1964，11（2）：75-79.

（收稿日期：2017-11-29 修回日期：2018-01-03）

（編輯：張 靜）