HPLC法同時(shí)測(cè)定桑菊感冒顆粒中5種有效成分的含量

崔佰吉 張宏梅 朱鶴云 馮波

中圖分類號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）12-1609-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.06

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定桑菊感冒顆粒中綠原酸、蘆丁、連翹苷、槲皮素和甘草酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為WondasilTM-C18，流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長為254 nm，進(jìn)樣量為5 μL。結(jié)果：綠原酸、蘆丁、連翹苷、槲皮素和甘草酸的檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.014～0.560 μg（r=0.999 2）、0.022～0.880 μg（r=0.999 6）、0.010～0.400 μg（r=0.999 9）、0.016～0.640 μg（r=0.999 9）、0.011～0.440 μg（r=0.999 1）；定量限分別為0.752、0.647、0.483、0.372、0.242 mg/L，檢測(cè)限分別為0.253、0.185、0.157、0.162、0.098 mg/L；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2.0%；加樣回收率分別為 97.4%～100.9%（RSD=1.4%，n=6）、95.7%～99.0%（RSD=1.1%，n=6）、95.1%～98.1%（RSD=1.3%，n=6）、96.4%～99.8%（RSD=1.4%，n=6）、97.8%～100.4%（RSD=1.0%，n=6）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于桑菊感冒顆粒中綠原酸、蘆丁、連翹苷、槲皮素和甘草酸含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 桑菊感冒顆粒；高效液相色譜法；綠原酸；蘆??；連翹苷；槲皮素；甘草酸；含量測(cè)定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the content determination of chlorogenic acid， rutin， phillyrin， quercetin and glycyrrhizic acid in Sangju ganmao granules. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on WondasilTM-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and the detection wavelength was set at 254 nm. The sample size was 5 μL. RESULTS： The linear range of chlorogenic acid， rutin， phillyrin， quercetin and glycyrrhizic acid were 0.014-0.560 μg（r=0.999 2），0.022-0.880 μg（r=0.999 6），0.010-0.400 μg（r=0.999 9），0.016-0.640 μg（r=0.999 9），0.011-0.440 μg（r=0.999 1）， respectively. The limits of quantitation were 0.752， 0.647， 0.483， 0.372， 0.242 mg/L； the limits of detection were 0.253， 0.185， 0.157， 0.162， 0.098 mg/L. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%. The average recoveries were 97.4%-100.9%（RSD=1.4%，n=6）， 95.7%-99.0%（RSD=1.1%，n=6）， 95.1%-98.1%（RSD=1.3%，n=6）， 96.4%-99.8%（RSD=1.4%，n=6）， 97.8%-100.4%（RSD=1.0%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable and reproducible， and can be used for simultaneous determination of chlorogenic acid， rutin， phillyrin， quercetin and glycyrrhizic acid in Sangju ganmao granules.

KEYWORDS Sangju gamao granules； HPLC； Chlorogenic acid； Rutin； Phillyrin； Quercetin； Glycyrrhizic acid； Content determination

桑菊感冒顆粒收載于《中藥成方制劑》（第二冊(cè)），執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為WS3-B-0397-90[1]。該方由菊花、桑葉、連翹、蘆根、甘草、苦杏仁、薄荷、桔梗等8味中藥材組成。方中菊花平息肝火、疏散風(fēng)熱，可輔助治療感冒、頭痛等[2]，桑葉滋陰補(bǔ)血、清肺潤燥、清熱疏風(fēng)、清肝明目[3]，二者合用具有清肺止咳、疏散上焦風(fēng)熱等功效[4]；連翹俗稱“一串金”，有消腫散結(jié)、清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效[5-6]；蘆根可用于治療熱病煩渴、胃熱嘔吐、肺熱咳嗽、肺癰吐膿、熱淋澀痛等癥[7]；甘草可用于治療癰疽瘡瘍、咽喉腫痛、氣喘咳嗽、脾胃氣虛等癥[8]；苦杏仁有潤腸通便、平喘鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛抗炎等功效[9-10]；薄荷為辛涼性發(fā)汗解熱藥，內(nèi)服可用于治療流行性感冒、咽喉腫痛、頭疼、目赤、身熱、牙床腫痛等癥，外用可用于治療神經(jīng)痛、皮膚瘙癢、皮疹和濕疹等癥[11]；桔梗具有宣肺排膿、鎮(zhèn)咳祛痰、消炎等功效[12]。

目前，該藥的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)方中有效成分進(jìn)行含量控制，同時(shí)2015年版《中國藥典》（一部）[13]中收載的桑菊感冒片僅對(duì)方中的連翹苷進(jìn)行含量測(cè)定。鑒于此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定了桑菊感冒顆粒中綠原酸、蘆丁、連翹苷、槲皮素、甘草酸的含量，以期為該藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)完善提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括LC20AT二元高壓梯度泵、SPDM20A二極管陣列檢測(cè)器、SIL20A自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-Solution色譜工作站（日本島津公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CPA225D型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：071229，純度：98.3%）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：080526，純度：99.5%）、連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：090106，純度：99.0%）均由上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司提供；槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081- 200907，純度：98.9%）、甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：110731-201317，純度：99.4%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；桑菊感冒顆粒（吉林醫(yī)藥學(xué)院藥物制劑研究室按標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-0397-90自制，批號(hào)：160401、160402、160403，規(guī)格：10 g/袋）；糊精（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20100712）；蔗糖（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20120510）；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WondasilTM-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，0→83% B；8～35 min，83%→30% B）；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：254 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取綠原酸、蘆丁、連翹苷、槲皮素和甘草酸銨對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加乙腈定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.635、0.326、0.310、0.317、0.639 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述單一對(duì)照品貯備液各適量，置于同一10 mL量瓶中，加乙腈稀釋并定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液（含綠原酸0.014 mg/mL、蘆丁0.022 mg/mL、連翹苷0.010 mg/mL、槲皮素0.016 mg/mL、甘草酸0.011 mg/mL）。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，研細(xì)，精密稱取粉末2.0 g，置于50 mL量瓶中，加乙腈40 mL，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）提取20 min，放冷至室溫，加乙腈定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-0397-90中桑菊感冒顆粒處方分別制備缺菊花、桑葉、連翹、蘆根、甘草的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備各陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、各陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，混合對(duì)照品各待測(cè)成分色譜峰分離良好，供試品各待測(cè)成分色譜峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，且在相同位置上陰性對(duì)照無干擾峰出現(xiàn)。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、5、10、20、40 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下各單一對(duì)照品貯備液適量，分別按照一定的比例進(jìn)行稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、連翹苷、槲皮素和甘草酸的定量限分別為0.752、0.647、0.483、0.372、0.242 mg/L；檢測(cè)限分別為0.253、0.185、0.157、0.162、0.098 mg/L。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、連翹苷、槲皮素和甘草酸峰面積的RSD分別為0.55%、0.09%、0.15%、0.19%、0.15%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：160401）適量，分別于室溫避光環(huán)境下放置0、4、6、8、10 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、連翹苷、槲皮素和甘草酸峰面積的RSD分別為0.38%、1.13%、0.53%、0.54%、0.70%（n=5），表明供試品溶液室溫避光環(huán)境下放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：160401）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各待測(cè)成分含量。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、連翹苷、槲皮素和甘草酸的平均含量分別為0.318、0.516、0.237、0.392、0.254 mg/mL，RSD 分別為 0.86%、1.32%、0.94%、1.30%、1.07%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品細(xì)粉（批號(hào)：160401）6份，每份1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入一定量的單一對(duì)照品貯備液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品細(xì)粉各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各3份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長的選擇

本試驗(yàn)中，通過結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器上得到的紫外吸收光譜圖，確定了各待測(cè)成分的最佳檢測(cè)波長分別為325 nm（綠原酸）、355 nm（蘆?。?、276 nm（連翹苷）、375 nm（槲皮素）、250 nm（甘草酸），但考慮到便于試驗(yàn)操作，且各待測(cè)成分在254 nm波長處均有較好的吸收，故選擇254 nm作為本研究的檢測(cè)波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本研究分別采用乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液以及甲醇-0.4%磷酸溶液5種流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，采用乙腈-0.4%磷酸溶液作為流動(dòng)相體系時(shí)的分離效果較好，且基線較穩(wěn)定，故選擇乙腈-0.4%磷酸溶液作為本研究的流動(dòng)相體系。

3.3 有效成分的選擇

桑菊感冒顆粒收載于《中藥成方制劑》（第二冊(cè)）[1]，原標(biāo)準(zhǔn)中沒有對(duì)有關(guān)成分進(jìn)行含量測(cè)定。桑菊感冒片收載于2015年版《中國藥典》（一部），且規(guī)定連翹苷含量的最低限度為0.16 mg/g[13]。本試驗(yàn)中測(cè)得樣品中連翹苷的平均含量為0.220 mg/g，符合2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。為更好地控制本制劑的內(nèi)在質(zhì)量，本試驗(yàn)增加了綠原酸、蘆丁、槲皮素和甘草酸的含量測(cè)定，且5種待測(cè)成分在同一色譜條件下可同時(shí)測(cè)定。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于桑菊感冒顆粒中綠原酸、蘆丁、連翹苷、槲皮素和甘草酸含量的同時(shí)測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì). 衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第2冊(cè)[S].1998：119-119.

[ 2 ] 瞿璐，王濤，董勇喆，等. 菊花化學(xué)成分與藥理作用的研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2015，38（1）：98-104.

[ 3 ] 歐陽臻，陳鈞. 桑葉的化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，24（6）：39-44.

[ 4 ] 茅純，鄭娟，鄒耀華. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定桑菊感冒片中綠原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷縖J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（1）：193-195.

[ 5 ] 吳國友. 連翹藥理作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，28（10）：1508-1509.

[ 6 ] 胡靜， 馬琳， 張堅(jiān)， 等. 連翹的研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2012，10（10）：760-764.

[ 7 ] 潘春燕，陳靜，杭太俊，等. HPLC法同時(shí)測(cè)定蘆根中對(duì)香豆酸和阿魏酸含量[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46（2）：219-223.

[ 8 ] 張友波，徐嵬，楊秀偉，等. RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地甘草中9個(gè)主要成分的含量[J].藥物分析雜志，2013，33（2）：214-219.

[ 9 ] 范學(xué)輝，張清安，劉梅，等. 苦杏仁脫苦方法研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2014， 35（7）：396-399.

[10] 鄭潤生，徐暉，王文麗，等. 苦杏仁中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)分析[J].中國中藥雜志，2013，38（20）：3534-3538.

[11] 徐凌玉，李振麟，蔡芷辰，等. 薄荷化學(xué)成分的研究[J].中草藥，2013，44（20）：2798-2802.

[12] 郭麗，張村，李麗，等. 中藥桔梗的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2007，32（3）：181-186.

[13] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1464-1465.

（收稿日期：2018-01-11 修回日期：2018-04-26）

（編輯：陳 宏）