疏肝健脾法對產(chǎn)后缺乳肝郁脾虛證大鼠泌乳干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

陳寶艷 李坤寅 甄玉花

〔摘要〕 目的 探討疏肝健脾法對產(chǎn)后缺乳肝郁脾虛證大鼠泌乳的干預(yù)作用。方法 采用甲磺酸溴隱亭溶液+慢性束縛法復(fù)制大鼠產(chǎn)后缺乳肝郁脾虛病證結(jié)合動(dòng)物模型，將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對照組，模型組，西藥對照組，中藥低、中、高劑量組，每組10只，通過大鼠宏觀表征、體質(zhì)量、每小時(shí)泌乳量、仔鼠窩凈增重、曠場實(shí)驗(yàn)、D-木糖排泄率觀察疏肝健脾法的干預(yù)作用。結(jié)果 與模型組相比，西藥對照組和中藥低、中、高劑量組均可改善缺乳大鼠的宏觀表征、增加大鼠體質(zhì)量和仔鼠凈增重，增加大鼠每小時(shí)泌乳量，增加大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)，增加大鼠尿D-木糖排泄率（P<0.05），且中藥中劑量組效果最好。結(jié)論 疏肝健脾法能促進(jìn)肝郁脾虛證產(chǎn)后缺乳大鼠泌乳，同時(shí)可改善大鼠宏觀表征、行為學(xué)表現(xiàn)及脾胃功能。

〔關(guān)鍵詞〕 疏肝健脾法;產(chǎn)后缺乳;肝郁脾虛證;動(dòng)物模型;泌乳量

〔中圖分類號(hào)〕R271.4;R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.005

產(chǎn)后缺乳屬于產(chǎn)后病范疇，是指產(chǎn)婦哺乳期間乳汁減少或無乳汁，而無法滿足嬰兒需求[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，產(chǎn)后缺乳的病機(jī)為氣血虧虛[2]、肝郁氣滯、肝郁脾虛等。前期研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后缺乳證型除單純虛證外，虛實(shí)夾雜證亦較常見，臨床上，肝郁脾虛證是最常見的證候之一[3]，亦有學(xué)者提出產(chǎn)后缺乳從肝胃論治[4]，因此，研究肝郁脾虛證產(chǎn)后缺乳具有更大的實(shí)際意義。因此，本研究以Wistar大鼠為造模載體，探討疏肝健脾法對產(chǎn)后缺乳肝郁脾虛證大鼠宏觀表征、體質(zhì)量、每小時(shí)泌乳量、仔鼠窩凈增重、曠場實(shí)驗(yàn)和D-木糖排泄率的影響，旨在為催乳辨證論治和中藥研發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康SPF級(jí)Wistar臨產(chǎn)期孕鼠為實(shí)驗(yàn)大鼠，20～24周，體質(zhì)量300～400 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-00034。實(shí)驗(yàn)大鼠在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)（許可證號(hào)：SYXK（粵）2013-0092），母、仔鼠按窩同籠飼養(yǎng)，室溫控制在22～24 ℃，濕度45%～65%。晝夜明暗交替時(shí)間12/12 h。大鼠體質(zhì)量及對應(yīng)每窩仔鼠總質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2? 藥品與試劑

中藥組方：在臨床實(shí)踐和前期研究工作基礎(chǔ)上[5-6]，本研究采用疏肝健脾法開展實(shí)驗(yàn)研究。本課題化裁組方為：柴胡15 g，當(dāng)歸10 g，白芍15 g，川芎10 g，漏蘆10 g，通草10 g，桔梗10 g，王不留行10 g，黨參30 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，炙甘草10 g。中藥在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研藥房按標(biāo)準(zhǔn)濃縮采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA）制備。具體操作如下：疏肝健脾方原方藥材重量為160 g/劑，將藥物置入煎鍋內(nèi)，加入8倍重量蒸餾水（1 280 mL），浸泡30 min后開始煎煮，煮沸后轉(zhuǎn)小火煮40 min，8層紗布過濾出藥液。再加入1 280 mL蒸餾水，二次煎煮后，濾出藥液。將上述藥液合并，離心（3 000 r/min）5 min后，減壓濃縮至對應(yīng)濃度的藥液（低濃度：1.109 g/mL，中濃度：2.218 g/mL，高濃度：4.435 g/mL）。課題設(shè)計(jì)低、中、高3個(gè)中藥劑量組，據(jù)前期研究結(jié)果，結(jié)合人與動(dòng)物劑量換算法，各組的給藥劑量分別為：低劑量組為16.8 g/kg，中劑量組為33.6 g/kg，高劑量組為67.2 g/kg（換算后與人的藥物劑量關(guān)系為1∶1、1∶2、1∶4）。甲磺酸溴隱亭片：匈牙利吉瑞大藥廠，2.5 mg/片（進(jìn)口藥品注冊證號(hào)：H20110116）。配制完成的溴隱亭放置于棕色瓶中或用錫箔紙包裹的玻璃瓶，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。甲氧氯普胺片：天津力生制藥股份有限公司? mg/片。D-木糖試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3? 主要儀器與設(shè)備

束縛筒：為塑料制品，主筒長18 cm，筒口直徑長6.5 cm，前端有一透氣孔，便于大鼠呼吸空氣，后端為可調(diào)節(jié)的閘門。自制木質(zhì)曠場箱：立方形，長×寬×高為100 cm×100 cm×40 cm，內(nèi)側(cè)壁及底面貼為黑色，用黑線劃分為20 cm×20 cm面積相等的25格。酶標(biāo)儀（Multiskan Mk3型）：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 動(dòng)物模型的建立

（1）實(shí)驗(yàn)第1～7天（溴隱亭溶液制備及大鼠灌胃）：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)以及人與動(dòng)物劑量換算法，給實(shí)驗(yàn)大鼠按照0.525 mg/（ kg·d ）灌服溴隱亭溶液。每天早、晚8時(shí)各1次，連續(xù)7 d。對照組予等體積的蒸餾水灌胃。（2）實(shí)驗(yàn)第 1～21 天（慢性束縛造模）：將大鼠置于自制束縛筒內(nèi)以限制大鼠活動(dòng)，并放于操作臺(tái)上，每天 3 h（10～13 時(shí)），連續(xù)21 d。

2.2? 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)

采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為6組，分別為：空白對照組（正常哺乳期大鼠）、模型組、西藥對照組（模型+甲氧氯普胺片）、中藥低劑量組（模型+中藥低劑量）、中藥中劑量組（模型+中藥中劑量）、中藥高劑量組（模型+中藥高劑量），每組10只，每籠1只。在實(shí)驗(yàn)第22～28天，予相應(yīng)干預(yù)，具體如下：西藥對照組予甲氧氯普胺片，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)以及人與動(dòng)物劑量換算法，按3.15 mg/（kg·d）體質(zhì)量給藥，每天早、晚 8 時(shí)各 1 次，連續(xù)7 d。換算得到的藥物低、中、高劑量濃度分別為1.109、2.218、4.435 g/mL。每天早晚8時(shí)各1次，連續(xù)7 d;模型組、空白對照組予等體積蒸餾水灌胃。

2.3? 觀察指標(biāo)

2.3.1? 大鼠宏觀表征? 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察大鼠的精神、毛色、耳廓、眼裂黏膜的顏色與光澤度、行為姿勢、活躍程度、糞便性狀、對束縛的反應(yīng)靈敏性等一般情況。

2.3.2? 大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、進(jìn)水量? 每天早8點(diǎn)用電子秤進(jìn)行大鼠體質(zhì)量、鼠糧稱質(zhì)量并記錄飲水量。

2.3.3? 大鼠每小時(shí)泌乳量? 根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的方法[7]，記錄大鼠每小時(shí)泌乳量和仔鼠窩凈增重（仔鼠窩凈增重=第28天窩仔鼠哺乳后總質(zhì)量-第1天隔離前仔鼠總質(zhì)量）。每日上午8點(diǎn)大鼠灌胃，灌胃 2 h以后，第1次稱質(zhì)量，使用電子稱稱取每窩仔鼠的總質(zhì)量W1，稱量后將大鼠與整窩仔鼠隔離開，隔離過程需注意保溫。母仔隔離4 h后，第2次稱質(zhì)量，稱取每窩仔鼠的總質(zhì)量W2，稱量后將大鼠與仔鼠同籠哺乳2 h，然后進(jìn)行第3次稱質(zhì)量，稱取整窩仔鼠的總質(zhì)量W3。按小時(shí)計(jì)算實(shí)驗(yàn)?zāi)甘蟮拿谌榱浚霉奖磉_(dá)為：

母鼠每小時(shí)泌乳量=W3-W2 +（W1-W2）/4

2.3.4? 曠場試驗(yàn)? 根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]，實(shí)驗(yàn)第1天、21天、28天分別觀察5 min內(nèi)大鼠在曠場箱內(nèi)的活動(dòng)情況。觀察指標(biāo)包括，水平運(yùn)動(dòng)：大鼠三爪以上均跨入相臨格的次數(shù);垂直運(yùn)動(dòng)：兩前肢離開箱底或攀伏在側(cè)壁上的次數(shù);修飾次數(shù)：大鼠以其前肢抓癢、洗臉、理毛或舔足的次數(shù)。

2.3.5? D-木糖排泄率? 測定采用D-木糖檢測試劑盒，以間苯三酚比色法測定。模型大鼠分別于實(shí)驗(yàn)的第21、28天21：00開始禁食11 h，相應(yīng)的第2天（即第22、29天）8時(shí)開始用代謝籠收集每只大鼠5 h（8～13時(shí)）的尿液，為未服D-木糖尿液;13時(shí)每只大鼠灌服10% D-木糖溶液，灌服量為1.5 g/kg，用代謝籠收集從13：10開始的每只大鼠5 h（13：10～18：10）尿液，為服D-木糖后尿液。以上過程禁食不禁水。取得的大鼠尿液當(dāng)天晚上按D-木糖檢測試劑盒（間苯三酚比色法）說明書進(jìn)行處理，根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]計(jì)算尿D-木糖排泄率。

2.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 19.0軟件，對數(shù)據(jù)做正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以“x±s”表示，組間比較采用ANOVA;進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，符合方差齊性，兩兩比較采用LSD法，若方差不齊，則采用Dunnetts T3法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05作為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1? 大鼠宏觀表征比較

造模前，大鼠產(chǎn)后精神狀態(tài)尚可、皮毛光澤、反應(yīng)較靈敏、大便成球形、干稀適中。束縛開始時(shí)，模型組大鼠呈反抗不安、煩躁?duì)顟B(tài)，之后轉(zhuǎn)變?yōu)樯駪B(tài)倦怠、閉眼、嗜臥、蜷縮，拱背、皮毛干枯無光澤、大便不成形或稀溏等。模型組大鼠進(jìn)食量、進(jìn)水量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而空白對照組的大鼠則仍反應(yīng)靈敏，皮毛有光澤，大便成球形、干稀適中。第29天，與模型組相比，各藥物治療組精神好轉(zhuǎn)，反應(yīng)尚靈敏，大便成球形、肛周無黃染，各治療組大鼠進(jìn)食量、進(jìn)水量均增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、圖2。

3.2? 大鼠體質(zhì)量和仔鼠窩凈增重比較

實(shí)驗(yàn)第1天、第7天、第14天各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異（P>0.05）。第21天空白對照組體質(zhì)量大于其余各組（P<0.05）。第28天，與空白對照組相比，模型組、西藥對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量大鼠體質(zhì)量降低（P<0.05）。與模型組相比，各治療組大鼠體質(zhì)量增高（P<0.05），空白對照組和中藥中劑量組高于其余治療組（P<0.05）。見圖3。

與空白對照組相比，模型組、西藥對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組仔鼠窩凈增重降低（P<0.05），與模型組相比，各治療組仔鼠凈增重升高（P<0.05），空白對照組和中藥中劑量組高于其余治療組（P<0.05）。見圖4。

3.3? 大鼠每小時(shí)泌乳量比較

實(shí)驗(yàn)第21天，與空白對照組相比，其余5組大鼠每小時(shí)泌乳量下降（P<0.05）。第28天，與模型組相比，空白對照組及治療組大鼠每小時(shí)泌乳量增多，西藥對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組大鼠每小時(shí)泌乳量高于模型組，但低于空白對照組和中藥中劑量組（P<0.05）。見圖5。

3.4? 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)第1天，各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第21天，與空白對照組相比，其余各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)均減少（P<0.05）。第28天，與模型組相比，其余五組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)、水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)均增多，西藥對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)、水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)多于模型組，但少于空白對照組和中藥中劑量組（P<0.05）。見圖6、圖7。在修飾次數(shù)方面，不同時(shí)期各組間修飾次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3.5? D-木糖排泄率

實(shí)驗(yàn)第22天，空白對照組大鼠D-木糖排泄率高于其余各組（P<0.05）。第29天，模型組大鼠D-木糖排泄率低于其余5組，西藥對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組D-木糖排泄率高于模型組，但少于空白對照組和中藥中劑量組（P<0.05）?？瞻讓φ战M大鼠D-木糖排泄率與中藥中劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖8。

4 討論

西醫(yī)學(xué)認(rèn)為，產(chǎn)后缺乳的發(fā)病原因，可能與乳腺發(fā)育不全、情緒焦慮或抑郁、產(chǎn)后哺乳不當(dāng)、體質(zhì)虛弱或營養(yǎng)不良等因素有關(guān)[10]。各種原因?qū)е碌膬?nèi)分泌紊亂致下丘腦分泌的催乳素釋放抑制因子分泌過多，并通過垂體門脈系統(tǒng)作用于垂體，抑制催乳素的合成及分泌[7-11]，或精神因素、心理因素抑制催乳素分泌，導(dǎo)致催乳素的合成和分泌減少，均可影響乳汁分泌。中醫(yī)學(xué)中，產(chǎn)后缺乳的病因多與氣血虛弱、肝郁脾虛、肝郁氣滯等有關(guān)。我們的前期研究提示，約47%的產(chǎn)后缺乳與肝郁有關(guān)[3]。這可能與現(xiàn)代女性工作、生活壓力大，易致情志抑郁且產(chǎn)后氣血虛弱、肝血不足，體內(nèi)激素水平改變、母親角色需適應(yīng)等因素有關(guān)。

從中醫(yī)學(xué)臟腑關(guān)系來看，肝與脾在生理、病理方面聯(lián)系密切、相互影響，肝氣郁滯，肝失疏泄，橫逆犯脾而克脾土，脾失健運(yùn)，則乳汁生化乏源，因此肝郁脾虛證是產(chǎn)后缺乳常見的中醫(yī)證型，治療應(yīng)以疏肝理氣、健脾養(yǎng)血、通絡(luò)下乳為主要治法。故本研究以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，模擬西醫(yī)病因病理，甲磺酸溴隱亭激活多巴胺受體抑制催乳素分泌，建立西醫(yī)大鼠產(chǎn)后缺乳模型;模擬中醫(yī)病機(jī)，慢性束縛致大鼠肝郁，肝疏泄不及、肝郁橫逆犯脾致肝郁脾虛，建立產(chǎn)后缺乳中醫(yī)證候模型，成功構(gòu)建了產(chǎn)后缺乳病證結(jié)合動(dòng)物模型，用于觀察疏肝健脾法對產(chǎn)后缺乳肝郁脾虛證大鼠泌乳的干預(yù)作用。

本研究采用的中藥是由下乳涌泉散（《清太醫(yī)院配方》）和四君子湯（《太平惠民和劑局方》）化裁而來。下乳涌泉散為疏肝養(yǎng)血、通絡(luò)下乳之良方[12-13]，四君子湯是健脾益氣的基礎(chǔ)方[14]。君藥柴胡具疏肝行氣之功，臣以黨參健脾養(yǎng)胃、補(bǔ)后天之本，輔以白術(shù)健脾燥濕，加強(qiáng)益氣助運(yùn)之力;當(dāng)歸、白芍為補(bǔ)血益氣、滋養(yǎng)肝體之品。佐以茯苓甘淡，補(bǔ)利兼優(yōu)，配白術(shù)健脾祛濕之功益著;王不留行、通草、漏蘆均為通乳之要藥，均可通絡(luò)下乳[15]，兼有行血活血清利之力，通草、漏蘆在治療產(chǎn)后缺乳中出現(xiàn)頻率較高[16]。以炙甘草、川芎、桔梗司使藥之職：炙甘草具有補(bǔ)脾和胃功效，川芎為血中之氣藥，具有活血行氣等功效，桔梗既升且降，善于開提肺氣，引藥上行。全方共奏疏肝理氣、健脾養(yǎng)血、補(bǔ)中益氣、通絡(luò)下乳之功。全方將辨病與辨證相結(jié)合，產(chǎn)后缺乳疾病的病理變化和肝郁脾虛證的證候特征相結(jié)合，所以收效較好。本研究提示中藥中劑量組療效優(yōu)于其他各藥物組，藥物干預(yù)后大鼠每小時(shí)泌乳量和仔鼠凈增重增加明顯，且大鼠宏觀表征有明顯改善、體質(zhì)量增加、進(jìn)食進(jìn)水量增加，表明疏肝健脾中藥不僅能促進(jìn)產(chǎn)后大鼠泌乳，還可有效改善大鼠整體狀態(tài)與身體機(jī)能，辨病療效較好。

曠場實(shí)驗(yàn)是最常用于測定大鼠情緒和心理狀態(tài)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，可用量化指標(biāo)客觀反映出大鼠的活動(dòng)性、探索性和抑郁、焦慮[17-18]。疏肝健脾中藥干預(yù)后的大鼠，其曠場實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)均明顯增加，提示疏肝健脾法可有效改善大鼠的肝郁狀態(tài)，與既往研究有較為一致的實(shí)驗(yàn)論點(diǎn)[19]。D-木糖代謝率是與小腸吸收功能成正相關(guān)的一個(gè)較為敏感和特異的檢測指標(biāo)，其水平的變化可以較為客觀地反映動(dòng)物的消化吸收和代謝功能，因此D-木糖排泄率常用于診斷脾虛證和評(píng)估藥物療效[20]。研究提示中藥各組均可提高大鼠尿D-木糖排泄率，且中劑量組效果最佳，提示疏肝健脾中藥對小腸吸收功能有改善作用，有效緩解納差、便溏等臨床癥狀。結(jié)果顯示，通過疏肝健脾法的藥物干預(yù)，一方面增加了大鼠泌乳量，另一方面也改善了大鼠肝郁脾虛的臟腑失衡狀態(tài)，將辨病與辨證相結(jié)合的中藥治療是干預(yù)本病的最佳途徑。

為觀察可能存在的劑量-效應(yīng)關(guān)系，中藥組設(shè)立了低、中、高3個(gè)組別，研究結(jié)果提示中藥中劑量組療效明顯優(yōu)于低、高劑量組，各項(xiàng)觀察指標(biāo)與空白對照組基本一致，這可能是由于低劑量組藥物濃度較低，達(dá)不到有效的治療效果，高劑量組可能由于濃稠的藥液阻礙脾胃功能的吸收所致，因此中劑量組療效最佳。

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