建立RSV聯(lián)合OVA誘發(fā)幼年大鼠哮喘模型的方法

李海霞 張勇華 任曉丹 孟欣茹 周娟娟 王輕輕 何芳 羅銀河

〔摘要〕 目的 探討呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus， RSV）滴鼻聯(lián)合卵清白蛋白（ovalbumin， OVA）霧化方法，建立大鼠哮喘模型的可行性。方法 將SD大鼠共30只隨機(jī)分為正常對照組（A組）、哮喘模型組（B組）和地塞米松組（C組）3組，每組10只，分別給予相應(yīng)干預(yù)，兩周后觀察大鼠反應(yīng)，應(yīng)用肺功能測量儀測定氣道阻力（Re值）、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF）中細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類，并觀察肺組織病理改變。結(jié)果 A組大鼠反應(yīng)及Re值基本正常，B組大鼠出現(xiàn)喘息表現(xiàn)，且測Re值明顯高于A組（P<0.05），C組大鼠較B組有所減輕;與A組比較，B組、C組BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高（P<0.01），以嗜酸性粒細(xì)胞比例為主（P<0.01），C組較B組BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞比例顯著下降（P<0.01）;肺組織病理A組支氣管肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，B組可見支氣管結(jié)構(gòu)紊亂、管壁增厚以及炎性細(xì)胞浸潤等，C組較B組有所減輕。結(jié)論 RSV聯(lián)合OVA誘發(fā)方法，能夠成功建立幼年大鼠哮喘模型，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 哮喘;動(dòng)物模型;聯(lián)合誘發(fā);呼吸道合胞病毒;卵清蛋白

〔中圖分類號〕R965.1;R562.2+5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.004

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘），作為小兒常見的呼吸系統(tǒng)疾病，不僅嚴(yán)重威脅了兒童的身心健康，也給家庭與社會(huì)帶來了巨大壓力。研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，大多數(shù)嬰幼兒均感染過呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）[3-4]。RSV感染與日后發(fā)生反復(fù)喘息甚至哮喘密切相關(guān)。氣道重塑是哮喘發(fā)病的重要病理特征，其過程有多種細(xì)胞因子參與，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和白介素-13（IL-13）等，既能反映氣道炎癥，又可參與氣道重塑，在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。目前很多學(xué)者從基礎(chǔ)和臨床方面進(jìn)行哮喘的相關(guān)研究[7-8]。因而，本文研究建立RSV感染動(dòng)物哮喘氣道重塑模型，可為今后臨床研究奠定一定的基礎(chǔ)，具體方法如下。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠30只，約3～4周齡，體質(zhì)量為（45±15）g，許可證號：SCXK（湘）2013-0005。飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房。室溫22～24 ℃，濕度50%～55%。

1.2? 實(shí)驗(yàn)試劑

乙酰膽堿（Ach），上海伊卡生物技術(shù)有限公司;RSV由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部病毒研究所提供;卵清白蛋白（ovalbumin， OVA）購自美國Simga公司。

1.3? 實(shí)驗(yàn)儀器

KYWH1004超聲霧化器（佛山市凱亞醫(yī)療科技有限公司）;HE-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）;TG-16WS臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;肺功能測量儀（國產(chǎn)FL998BC）。

2 方法

2.1? 分組

將大鼠30只隨機(jī)分為正常對照組（A組）、哮喘模型組（B組）、地塞米松組（C組），每組10只。

2.2? 造模

參照文獻(xiàn)[9]中方法，將B、C組于實(shí)驗(yàn)第1、2天均以RSV鼻腔滴入25 μL，并于背部、雙下肢外側(cè)以10%OVA皮下注射，共0.25 mL。A組大鼠以同等劑量Hep-2細(xì)胞滴鼻，同部位同體積予生理鹽水皮下注射;自實(shí)驗(yàn)第9天起，B、C組均予以1%OVA霧化吸入激發(fā)0.5 h/次，隔日1次，持續(xù)2周。A組以生理鹽水霧化作為對照。C組于激發(fā)前0.5 h予地塞米松生理鹽水溶液灌胃，每日1次，持續(xù)2周。A、B組予生理鹽水灌胃。

2.3? 取材

末次灌胃2 h后，麻醉，以不同濃度的Ach應(yīng)用肺功能測量儀測定氣道反應(yīng)性后，分離肺葉留作灌洗，并取出支氣管及左肺，PBS沖洗后放入4%多聚甲醛中固定，密閉保存。固定24 h后備用。

2.4? 指標(biāo)檢測

2.4.1? 大鼠反應(yīng)及形態(tài)變化? 觀察并記錄大鼠呼吸、毛色、口唇顏色、反應(yīng)、動(dòng)作，以及后期質(zhì)量、毛發(fā)、精神狀態(tài)等。

2.4.2? 氣道反應(yīng)性測定? 大鼠麻醉后，用剪刀V型剪開氣管，將深靜脈穿刺針進(jìn)行氣管插管，插入約3～4 cm后固定。找到頸靜脈，穿入留置針并固定;接小動(dòng)物呼吸機(jī)，設(shè)置呼吸頻率75次/min，吸呼比為1∶1，潮氣量為8 mL/kg，連接肺功能測量儀;推入生理鹽水0.5 mL，記錄氣道阻力（Re值）;再由低濃度至高濃度依次注入Ach各0.5 mL，并分別記錄測定的Re值，隔約3～4 min/次。

2.4.3? 支氣管灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類? 分離右側(cè)支氣管及肺葉進(jìn)行灌洗，抽取回收液約5～6 mL，離心，倒出液體，沉渣用1 mL PBS液重懸。取10 μL重懸液稀釋到1 mL PBS里，取10 μL稀釋液，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制備細(xì)胞涂片，光鏡下將白細(xì)胞作細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，取其平均值，并求百分比。

2.4.4? 肺組織病理觀察? 收集BALF完成后立刻分離并取出左支氣管及肺葉，經(jīng)洗滌、梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，在200倍光鏡下觀察，隨機(jī)選取3～4個(gè)形態(tài)規(guī)整的支氣管橫斷面，直徑約100～200 μm進(jìn)行觀察。

2.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以“x±s”表示，采用SPSS 20.0軟件。多組間多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 大鼠反應(yīng)及形態(tài)變化

A組大鼠未見異常反應(yīng);B組大鼠可見有點(diǎn)頭樣喘息、口唇紫紺、煩躁、易激惹、搔鼻、弓肩聳肩、抓耳等表現(xiàn)。反復(fù)激發(fā)后，體質(zhì)量增長緩慢，毛發(fā)欠光澤，精神差;C組大鼠喘息等相關(guān)癥狀較B組減輕。

3.2? 大鼠氣道反應(yīng)性

各組大鼠Re值基礎(chǔ)水平（生理鹽水）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.091），但其Re值隨Ach濃度升高而增加，予濃度為15 μg/kg的Ach激發(fā)，其Re值結(jié)果發(fā)現(xiàn)B組比A組增加明顯（P=0.038）;當(dāng)以濃度為30～120 μg/kg的Ach激發(fā)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B組大鼠Re值較A組比較顯著增加（P=0.000）。見表1。

3.3? BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類

B、C組較A組白細(xì)胞總數(shù)顯著增多（P<0.01），C組較B組有所下降，差異具有顯著意義（P<0.01）。從細(xì)胞分類上看，發(fā)現(xiàn)B、C組較A組結(jié)果嗜酸性粒細(xì)胞百分比增加顯著（P<0.01），B組與A組比較，中性粒細(xì)胞百分比升高（P<0.05），而淋巴細(xì)胞百分比增高不明顯（P>0.05）;與B組比較，C組嗜酸性粒細(xì)胞百分比顯著下降（P<0.01），中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比無明顯變化（P>0.05）。見表2。

3.4? 肺組織病理變化

鏡下可見，A組支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)基本正常;B組支氣管、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，氣道上皮細(xì)胞壞死、脫落;氣管腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤;管壁增厚、管腔狹窄，可見黏液栓形成，黏膜下基質(zhì)可見較多膠原樣物質(zhì)沉積。C組與B組比較，可見支氣管管壁無明顯增厚、管腔尚規(guī)則、上皮有少量炎性細(xì)胞浸潤，氣道平滑肌輕度增厚。見圖1。

4 討論

氣道重塑是1922年最早由HUBER和KOESSLER發(fā)現(xiàn)[10]，其病理特征包括：支氣管管壁增厚、基底膜膠原蛋白沉積，氣道平滑肌肥大，成纖維細(xì)胞增殖及黏液腺杯狀細(xì)胞化生及增生等。其結(jié)果是產(chǎn)生持續(xù)的氣道高反應(yīng)性和不可逆性氣道狹窄而成為哮喘遷延反復(fù)的病理基礎(chǔ)。因此，運(yùn)用合適的方式建立動(dòng)物哮喘氣道重塑模型對于今后研究臨床藥物治療具有重要意義[11]。本實(shí)驗(yàn)建立哮喘氣道重塑模型，經(jīng)過各方面比較，提示運(yùn)用RSV感染合并OVA致敏激發(fā)的方法建立SD大鼠哮喘模型具有可操作性，其病理形態(tài)學(xué)符合氣道重塑的特點(diǎn)。且應(yīng)用RSV活病毒感染與臨床上RSV感染和哮喘發(fā)病密切相關(guān)的實(shí)際接近，并符合臨床RSV誘發(fā)哮喘的發(fā)病的病理生理特征。因此，此方法能夠建立一種較理想的大鼠哮喘氣道重塑模型，可為進(jìn)一步研究中醫(yī)藥干預(yù)哮喘發(fā)病環(huán)節(jié)及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] BASEDOVSKY H O， SORKIN E. Network of immune-neuro-endocrine interations[J]. Chin Exp Immunol， 1977，27（1）：1-12.

[2] CHESNOKOVA V， MELMED S， MINIREVIEW. Neuro-immuno-endocrine modulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal （HPA） axis by gp130 signaling molecules[J]. Endocrinology， 2002，143（5）：1571-1574.

[3] DOMACHOWSKE J B， ROSENBERG H F. Respiratory syncytial virus infection：immune response，immunopathogenesis，and treatment[J]. Clin Microbiol Rev，1999，12（2）：298-309.

[4] GLEZEN W P， TABER L H， TABER L H， et al. Risk of primary infection and reinfection with respiratory syncytial virus[J].Am J Dis Child， 1986，140（6）：543-546.

[5] LAITINEN L A， HEINO M， LAITIEN A， et al. Damage of the epithelium and bronchial reactivity in patients with asthma[J]. Am Rev Respir Dis， 1985，131（4）：599-606.

[6] DUNNILL M， MASSARSLLA G， ANDERSON J. Comparison of the quantitative anatomy of the bronchial in normal subjects， in status asthmatics， in chronic bronchitis， and in emphysema[J].Thorax， 1969，24（2）：176-179.

[7] 鄧桂明，蔣司晨，肖小芹，等.咳喘穴位敷貼對哮喘大鼠肺組織JAK1、STAT6表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（5）：514-518.

[8] 孔慶活，唐興榮，馮玉蓮，等.小青龍湯加減對支氣管哮喘慢性持續(xù)期患者PEF的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（5）：530-532.

[9] 童黃錦，范欣生，許惠琴，等.一種病毒性哮喘模型制作方法的建立及評價(jià)[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，39（3）：349-352.

[10] HUBER P， MENIF K， JOUNET P. Acute severe asthma in pediatric resuscitation. The French Study Group on Pediatric Resuscitation[J]. Arch Pediatr，1994，1（4）：346-349.

[11] 廖肇發(fā).不同霧化吸入方式治療哮喘的效果評價(jià)[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36（A1）：24-25.