RP—HPLC法測定不同產(chǎn)地杉寄生藥材中落新婦苷和蘆丁的含量

梁可 申茹 蔡燕瑜 謝曉梅 黃楚敏 陳文

中圖分類號 R284.2；R284.1 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1769-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.10

摘 要 目的：建立同時測定杉寄生藥材中2種黃酮類成分落新婦苷和蘆丁含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，并比較不同產(chǎn)地藥材中2種成分的含量。方法：色譜柱為SHISEIDO-SPOLAR C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（14 ∶ 86，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為291 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL；對來源于廣西和廣東6個市/縣的杉寄生藥材進行含量測定及比較分析。結(jié)果：落新婦苷和蘆丁的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為22～440、12～240 μg/mL（r分別為0.999 6、0.999 1），平均加樣回收率分別為99.44%、99.96%（RSD分別為1.38%、1.50%，n=9）；杉寄生中落新婦苷含量在各省/區(qū)及各市/縣之間均相似（0.862 5～0.901 1 mg/g），蘆丁含量在同一省/區(qū)的市/縣間相似，但在2個省/區(qū)之間差異較大（平均值分別為0.431 3 、0.214 9 mg/g）。結(jié)論：本法簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可用于杉寄生藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 杉寄生；落新婦苷；蘆??；反相高效液相色譜法；含量測定；產(chǎn)地

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish RP-HPLC method for simultaneous determination of astilbin and rutin in Macrosolen cochinchinensis， and to compare the contents of 2 components in medicinal material from different producing areas. METHODS： The determination was performed on SHISEIDO-SPOLAR C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （14 ∶ 86， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 291 nm， and column temperature was 35 ℃， the sampling volume is 10 μL.Content determination and comparative analysis of M. cochinchinensis from 6 counties of Guangxi and Guangdong were conducted. RESULTS： The linear range of astilbin and rutin were 22-440 μg/mL （r=0.999 6） and 12-240 μg/mL （r=0.999 1）； average recoveries were 99.44% （RSD=1.38%， n=9） and 99.96% （RSD=1.50%， n=9）. The contents of astilbin in M. cochinchinensis were similar between provinces/autonomous region or among cities/counties （0.862 5- 0.901 1 mg/g）； the contents of rutin were similar among cities/counties in same provinces/autonomous region but there was a great difference between provinces/autonomous region （average values were 0.431 3， 0.214 9 mg/g）. CONCLUSIONS： This method is simple， accurate， stable and reproducible for the quality control of M. cochinchinensis.

KEYWORDS Macrosolen cochinchinensis； Astilbin； Rutin； RP-HPLC； Content determination； Producing area

杉寄生藥材為桑寄生科植物鞘花[Macrosolen cochinchinensis （Lour.） Van Tiegh.]的莖枝，收載于《中華本草》，具有祛風(fēng)濕、補肝腎、活血止痛、止咳、止痢的功效，主要分布于華南、西南地區(qū)，為民間和臨床常用中藥[1]。目前對該藥材的研究主要為性狀、顯微及成分分析，對其有效成分的含量測定及藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)研究較少，故有關(guān)其質(zhì)量控制的研究意義更大。

杉寄生藥材中黃酮類成分主要為落新婦苷和蘆丁[2-3]。研究表明，落新婦苷具有選擇性免疫抑制作用、調(diào)節(jié)脂肪及膽固醇代謝作用[4]，以及抗炎、利尿、鎮(zhèn)痛等作用[5]；蘆丁具有抗心肌缺氧、缺血、降低血清膽固醇、抑制血小板集聚、抗炎、抗過敏、抗病毒和增強免疫力等活性作用[6]，這2種成分的活性與杉寄生的功效密切相關(guān)。因此，筆者在本文中建立了同時測定杉寄生中落新婦苷和蘆丁含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，并對來源于不同產(chǎn)地的6批杉寄生藥材進行分析與比較，為有效控制杉寄生藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；PS-40A超聲儀（深圳市科潔超聲科技有限公司）；FA2004N萬分之一電子天平（上海青海儀器有限公司）；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品、對照品與試劑

落新婦苷對照品（批號：160604，純度：≥98%）、蘆丁對照品（批號：170322，純度：≥98%）均來源于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；6批杉寄生藥材分別收集于廣西河池（批號：20161115）、廣西南寧（批號：20161203）、廣西桂林（批號：20170211）、廣東和平（批號：20161002）、廣東博羅（批號：20161005）、廣東梅縣（批號：20161112），經(jīng)惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥教研室祁銀德副教授鑒定為桑寄生科植物鞘花的干燥莖枝；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材提取工藝優(yōu)化

采用正交試驗篩選藥材提取方法，制備供含量測定用的供試品溶液，以甲醇為提取溶劑。

2.1.1 正交試驗 參考文獻[7-12]以及在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，精密稱定來源于廣西河池的杉寄生藥材粉末（過三號篩）2 g，置于具塞錐形瓶中，選用超聲提取法，以溶劑體積分數(shù)（A）、液料比（B）、提取次數(shù)（C）和提取時間（D）為考察因素，按L9（34）正交表設(shè)計試驗。將各試驗號所得濾液合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，濾過，取續(xù)濾液按“2.2”項下色譜條件測定含量。

以落新婦苷和蘆丁含量為考察指標(biāo)進行綜合評分，由于落新婦苷的生物活性[4]與杉寄生功效更為吻合，且前期試驗顯示落新婦苷提取率更高，故評分時設(shè)定落新婦苷含量的權(quán)重為0.7、蘆丁含量的權(quán)重為0.3。因素與水平見表1，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表2和表3可知，各因素的影響大小依次為C>A>B>D，即提取次數(shù)對綜合評分影響最大，其次為溶劑體積分數(shù)和液料比，提取時間影響最小?？紤]操作的方便與效率，選擇最優(yōu)提取工藝為A2B2C3D2，即以70%甲醇為提取溶劑，12倍量超聲提取3次，每次45 min。

2.1.2 驗證試驗 稱取同一批藥材粉末約2 g，3份，精密稱定，按最優(yōu)提取工藝進行驗證試驗，結(jié)果顯示該提取工藝條件穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性好。驗證試驗結(jié)果見表4。

2.2 落新婦苷和蘆丁的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：SHISEIDO-SPOLAR C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14 ∶ 86，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：291 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，取“2.2.2”項下對照品和供試品溶液進樣分析，結(jié)果在供試品溶液色譜中，落新婦苷和蘆丁均可完全分離，峰形較好；蘆丁、落新婦苷峰理論板數(shù)分別為11 208、8 992，各峰間分離度均大于1.5。3種溶液的色譜圖見圖1。

2.2.2 溶液制備 （1）對照品溶液。取落新婦苷對照品、蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含落新婦苷0.44 mg、蘆丁0.6 mg的對照品溶液，即得。（2）供試品溶液。取廣西河池的杉寄生藥材粉末（過三號篩）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲3次（功率：250 W，頻率：40 kHz），每次45 min，濾過，合并濾液，蒸干，殘渣用70%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 線性關(guān)系及定量限考察 （1）落新婦苷。分別精密吸取落新婦苷對照品溶液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為22、44、88、132、220、440 μg/mL的系列對照品溶液。吸取各對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣分析。以質(zhì)量濃度（c，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得落新婦苷的回歸方程為A=22 151c-65.335（r=0.999 6）。結(jié)果表明，落新婦苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍為22～440 μg/mL。根據(jù)相應(yīng)方法進行操作，落新婦苷定量限為0.5 μg/mL。（2）蘆丁。分別精密吸取蘆丁對照品溶液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為12、30、60、84、120、240 μg/mL的系列對照品溶液。吸取各對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣分析。同“（1）”方法得蘆丁的回歸方程為A=10 165c-27.545（r=0.999 1）。結(jié)果表明，蘆丁檢測質(zhì)量濃度線性范圍為12～240 μg/mL，定量限為1.2 μg/mL。

2.2.4 精密度試驗 分別精密吸取落新婦苷、蘆丁2種對照品溶液各10 μL，分別連續(xù)進樣6次，測定落新婦苷和蘆丁的峰面積，計算其RSD分別為0.70%、2.88%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批廣西河池供試品溶液適量，分別于0、4、8、12、16、24 h內(nèi)各進樣10 μL，測定落新婦苷、蘆丁的峰面積，計算其RSD分別為1.62%、1.18%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批廣西河池供試品約2 g，共6份，分別按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，進樣測定落新婦苷和蘆丁的含量，計算其RSD分別為1.57%和0.78%（n=6），表明該測定方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知落新婦苷含量和蘆丁含量的樣品（過三號篩）0.5 g，共9份，每3 份為一組，每組分別精密加入落新婦苷和蘆丁對照品溶液各0.5、1.0、1.5 mL，制備成供試品溶液，進樣測定，計算2種成分的回收率。結(jié)果表明，落新婦苷、蘆丁的平均回收率分別為99.44%、99.96%（RSD=1.38%、1.50%，n=9），具體詳見表5。

2.3 不同產(chǎn)地樣品含量測定

取不同產(chǎn)地杉寄生樣品各3份，分別按“2.2.2（2）”項下方法制備成供試品溶液，再按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積，按外標(biāo)法計算不同產(chǎn)地杉寄生樣品中落新婦苷和蘆丁的含量，結(jié)果見表6。

由表6可見，杉寄生中落新婦苷含量在各省/區(qū)及各市/縣之間均相似（0.862 5～0.901 1 mg/g），蘆丁含量在同一省/區(qū)的市/縣間相似，但在2個省/區(qū)之間差異較大（平均值分別為0.431 3、0.214 9 mg/g）。

3 討論

筆者在前期試驗中，經(jīng)HPLC全波長掃描確定了291 nm為杉寄生中黃酮類成分的檢測波長；另分別考察了甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等流動相對分離效果的影響。結(jié)果顯示，選用甲醇-0.2%磷酸水溶液 （70 ∶ 30，V/V）及乙腈-0.2%磷酸水溶液（20 ∶ 80，V/V）時，蘆丁保留時間過短，分離效果不佳，并考慮到酸度對色譜柱的影響，最終選用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相。再對流動相中二者體積比經(jīng)過多次調(diào)整和考察，確定當(dāng)體積比為14 ∶ 86時，落新婦苷和蘆丁的保留時間適合，峰形好，分離度及理論板數(shù)高。

同時測定落新婦苷和蘆丁含量在其他藥物制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中已有相關(guān)研究[7]，但在杉寄生藥材中同時測定此2種成分尚為首次報道。此外，本研究進行了供試品溶液制備的提取工藝考察，且對色譜條件進行了優(yōu)化，使杉寄生藥材及制劑的質(zhì)量控制結(jié)果更準(zhǔn)確。

目前杉寄生道地藥材產(chǎn)區(qū)還有待進一步明確，前期調(diào)查研究顯示，該藥材主產(chǎn)地為華南地區(qū)，為廣西和廣東地區(qū)民間臨床常用藥材，故本研究選用這2個省/區(qū)不同市/縣的藥材進行比較。試驗結(jié)果表明，杉寄生中蘆丁含量在2個省/區(qū)之間差異較大，證實地理環(huán)境對杉寄生藥材質(zhì)量有一定影響。筆者認為這是由于杉寄生藥材多為野生所致，且藥材的生產(chǎn)年限、采收時間、加工及產(chǎn)地等對藥材的質(zhì)量也有影響，故這些因素與藥材質(zhì)量的相關(guān)性有待進行深入研究。

參考文獻

[ 1 ] 《中華本草》編委會.中華本草：第2冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：600-601.

[ 2 ] 陸國壽，盧文杰，陳家源，等.杉寄生化學(xué)成分[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（3）：44-46.

[ 3 ] 陸國壽，葉勇，盧文杰，等. HPLC法測定杉寄生中落新婦苷的含量[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，20（5）：86-87.

[ 4 ] 張清峰，聶海純，鄭國棟，等.落新婦苷的理化性質(zhì)與生物活性研究進展[J].現(xiàn)代食品科技，2012，28（12）：1834- 1838.

[ 5 ] 張白嘉，劉亞歐，劉榴，等.土茯苓及落新婦苷抗炎、鎮(zhèn)痛、利尿作用研究[J].中藥藥理與臨床，2004，20（1）：11-12.

[ 6 ] 馬溶，龐廣昌.蘆丁對現(xiàn)代文明病的作用[J].食品科學(xué)，2013，34（7）：307-311.

[ 7 ] 蔡果，龔春燕，申國慶. HPLC法同時測定復(fù)方土茯苓膠囊中落新婦苷和蘆丁的含量[J].中國藥房，2012，23（47）：4486-4488.

[ 8 ] 白梅，劉為萍，李素珍. HPLC測定不同產(chǎn)地土茯苓中落新婦苷和黃杞苷含量[J].藥物分析雜志，2013，33（8）：1352-1354.

[ 9 ] 劉東平，廖啟元，劉娛姍.土茯苓中落新婦苷含量測定方法改進的研究[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2016，39（2）：141- 143.

[10] 方圓，王雪彥，晁若冰.土茯苓藥材中落新婦苷和總黃酮的含量測定方法研究[J].藥物分析雜志，2010，30（9）：1738-1741.

[11] 韓光明，張艷艷，劉加秀.正交試驗優(yōu)選蒲苓盆炎康膠囊中落新婦苷的提取工藝[J].中國藥房，2015，26（31）：4421-4423.

[12] 林耿豐，梁偉杰，肖鳳霞.正交設(shè)計法優(yōu)選土茯苓中落新婦苷及總黃酮的提取工藝[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7（6）：39-42.

（收稿日期：2017-12-12 修回日期：2018-02-06）

（編輯：劉 萍）