濁點(diǎn)萃取結(jié)合UPLC—MS/MS法測(cè)定氣道炎癥模型豚鼠灌胃射干提取物后血漿中LTB4的濃度

楊瑞 邸子真 吳怡 陶弘武

摘 要 目的：建立測(cè)定氣道炎癥豚鼠血漿中白三烯B4（LTB4）濃度的方法，考察給予射干提取物后其對(duì)豚鼠血漿中LTB4濃度的影響，為闡明射干提取物抗炎止咳的作用機(jī)制提供參考。方法：將30只豚鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和射干提取物組，每組10只。除空白組外，其余2組豚鼠采用煙熏+合胞病毒滴鼻法制造氣道炎癥模型。造模結(jié)束后次日，射干提取物組豚鼠灌胃給藥（10 mg/kg射干提取物，以野鳶尾黃素計(jì)），空白組和模型組豚鼠灌胃等體積生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d，末次給藥后收集血漿樣品。分別考察表面活性劑Triton X-114濃度、鹽酸濃度、鹽酸加入量、平衡溫度和平衡時(shí)間對(duì)LTB4提取回收率的影響（以44.5 g/L的牛血清白蛋白生理鹽水溶液替代空白血漿），確定最優(yōu)濁點(diǎn)萃取工藝進(jìn)行生物樣品處理。然后以吲哚美辛為內(nèi)標(biāo)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測(cè)定血漿中LTB4濃度。色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，流動(dòng)相為0.2%甲酸水-乙腈（40 ∶ 60，V/V），流速為0.4 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL；MS條件：電噴霧離子源，正離子模式下掃描，LTB4用于定量的離子為[M+H]+質(zhì)荷比（m/z）335.219 4→195.099 8，吲哚美辛為[M+H]+ m/z 356.083 6→312.084 2。結(jié)果：濁點(diǎn)萃取最優(yōu)條件為T(mén)riton X-114濃度5%，加入0.3 mol/L鹽酸50 μL調(diào)至酸性、平衡溫度50 ℃，平衡時(shí)間20 min。在該含量測(cè)定條件下方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果均符合相關(guān)要求。與空白組比較，模型組豚鼠血漿中LTB4濃度顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，射干提取物組豚鼠血漿中LTB4濃度顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：本研究中樣品處理方法綠色環(huán)保，含量檢測(cè)方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，適用于血漿中LTB4濃度的測(cè)定；射干提取物可使氣道炎癥豚鼠血漿中升高的LTB4濃度得到顯著回調(diào)。

關(guān)鍵詞 濁點(diǎn)萃?。怀咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法；射干提取物；白三烯B4；豚鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for determining the concentration of leukotriene B4 （LTB4） in plasma of airway inflammatory guinea pigs， investigate the effects after giving Belamcanda chinensis extract on plasma concentration of LTB4 in guinea pigs and provide reference for clarifying the mechanism of anti-inflammatory and antitussive effects of B. chinensis extract. METHODS： Totally 30 guinea pigs were randomly divided into blank group， model group and B. chinensis extract group， with 10 guinea pigs in each group. Except for blank group， airway inflammation model was induced by smokation+syncytial virus intranasal method in other 2 groups. At next day after modeling， guinea pigs were given relevant medicine （10 mg/kg B. chinensis extract， calculated by irigenin） intragastrically in B. chinensis extract group； blank group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 7 d， and the plasma samples were collected after last administration. Then， the effects of surface active agent Triton X-114 concentration， hydrochloric acid concentration， hydrochloric acid amount. Equilibrium temperature and equilibrium time on extraction recovery rate of LTB4 were investigated （using 44.5 g/mL BAS saline solution instead of blank plasma）. The optimal cloud point extraction technology was determined for biological sample treatment. Using indometacin as internal standard， UPLC- MS/MS method was used to determine the concentration of LTB4 in plasma. Chromatographic conditions： the chromatographic column is ACQUITY UPLC BEH C18， the mobile phase is 0.2% formic acid-acetonitrile （40 ∶ 60，V/V）， flow rate is 0.4 mL/min， column temperature is 40 ℃， sample volume is 5 ?L. MS condition： Electrospray ion source， positive ion mode scanning， and the LTB4 used for the [M+H]+ mass ratio （m/z） 335.219 4→195.099 8， Indomethacin is [M+H]+ m/z 356.083 6→312.084 2. RESULTS： The optimal cloud point extraction condition included Triton X-114 concentration 5%， added into 0.3 mol/L hydrochloric acid 50 μL adjusted to acid and equilibrium temperature 50 ℃， for 20 min. The results of methodology validation were all in line with the content determination requirements. Compared with blank group， the plasma concentration of LTB4 in guinea pigs was increased significantly in model group （P<0.05）. Compared with model group， the plasma concentration of LTB4 in guinea pigs was decreased significantly in B. chinensis extract group （P<0.05）. CONCLUSIONS： The method of sample processing is environmental friendly， and the content determination method is high sensitivity and accuracy， and applicable for determination of LTB4 in plasma samples. B. chinensis extract can significantly regulate the increase of LTB4 concentration in plasma of guinea pigs with airway inflammation.

KEYWORDS Cloud point extraction； UPLC-MS/MS； Belamcanda chinensis extract； Leukotriene B4； Guinea pig

隨著綠色化學(xué)的發(fā)展，生物樣品分析技術(shù)逐漸向著不使用或者盡可能少使用有機(jī)溶劑的方向發(fā)展。目前，在生物樣品的測(cè)試過(guò)程中，樣品的前處理及分析過(guò)程中需要大量的有機(jī)試劑，產(chǎn)生了大量的化學(xué)污染物。因此，發(fā)展“創(chuàng)新、綠色”的生物樣品分析技術(shù)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。濁點(diǎn)萃?。–loud point extraction，CPE）是一種新型的液-液萃取技術(shù)，利用非離子表面活性劑的增溶作用和在濁點(diǎn)溫度時(shí)兩相分離而達(dá)到對(duì)待測(cè)物分離富集的效果。相比于傳統(tǒng)的生物樣品前處理方法，CPE技術(shù)具有萃取效率高、富集因子大、不使用有機(jī)溶劑、對(duì)環(huán)境和操作人員危害小、表面活性劑易于處理、易與其他分析儀器聯(lián)用、便于進(jìn)行大規(guī)模操作等優(yōu)勢(shì)[1]。目前，CPE技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物樣品分析領(lǐng)域[2-4]。

白三烯B4（LTB4）是花生四烯酸在脂氧酶代謝途徑中的產(chǎn)物，為變應(yīng)性疾病發(fā)病的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)[5-8]，具有強(qiáng)大的細(xì)胞趨化作用，可吸引包括淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞向炎癥反應(yīng)部位聚集和激活[9]。前期研究表明[10-12]，射干提取物具有良好的抗炎、止咳多靶標(biāo)作用，能夠顯著抑制花生四烯酸的脂氧酶和環(huán)氧合酶代謝。本研究在此基礎(chǔ)上，采用CPE技術(shù)，并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC- MS/MS）法監(jiān)測(cè)射干提取物灌胃給藥后氣道炎癥豚鼠血漿中的LTB4濃度的變化，為射干提取物抗炎、止咳機(jī)制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Xevo G2-XS 超高效液相色譜-飛行質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-QTOF-MS）儀、Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；XS105分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SIGMA3-18K低溫冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

射干藥材購(gòu)自湖北射干種植基地，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為鳶尾科射干屬植物射干 Belamcanda chinensis （L.） DC.的干燥根莖；LTB4對(duì)照品（美國(guó)Cayman Chemical公司，批號(hào)：0466969-14，純度：≥97.0%）；吲哚美辛對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100258-200904，純度：99.9%）；牛血清白蛋白（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：B0040）；甲醇、乙腈（美國(guó)Fisher Scientific公司，質(zhì)譜純）；表面活性劑曲拉通X-114（Triton X-114，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；水為自制超純水。

1.3 病毒

呼吸道合胞病毒購(gòu)自廣州博特生物有限公司。

1.4 動(dòng)物

SPF級(jí)Hartley豚鼠30只，♂，體質(zhì)量250～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.2%甲酸-乙腈（40 ∶ 60，V/V）；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 MS條件 電噴霧離子源（ESI），離子源溫度：100 ℃；毛細(xì)管電壓：3 kV；錐孔電壓：40 V；脫溶劑氣溫度：350 ℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣流速：800 L/h；正離子模式檢測(cè)，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），掃描時(shí)間為0.5 s；LTB4用于定量的離子為 [M+H]+質(zhì)荷比（m/z）：335.219 4→195.099 8，碰撞能量（CE）：16 V；內(nèi)標(biāo)吲哚美辛用于定量的離子為[M+H]+ m/z：356.083 6→312.084 2，CE：9 V。

2.2 溶液的制備

2.2.1 LTB4對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取LTB4對(duì)照品10.00 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得1 mg/mL的LTB4儲(chǔ)備液；甲醇逐級(jí)稀釋儲(chǔ)備液制成LTB4質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200、250、500、800、1 000 μg/L的LTB4系列對(duì)照品溶液。其中，20、250、800 μg/L的LTB4溶液為質(zhì)控（QC）用對(duì)照品溶液，其余為標(biāo)準(zhǔn)曲線用對(duì)照品溶液。

2.2.2 吲哚美辛內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱(chēng)取吲哚美辛對(duì)照品11.25 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得1.124 mg/mL的吲哚美辛儲(chǔ)備液；取儲(chǔ)備液再用甲醇稀釋為質(zhì)量濃度為112.4 μg/L的吲哚美辛內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 射干提取工藝

取射干藥材 1 kg，分別加8、6倍量70%乙醇提取2次，分別提取1、0.5 h，濾過(guò)，收集上清液并濃縮，減壓干燥，即得射干提取物，出膏率為4.8%（經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)，提取物中含野鳶尾黃素1.88 mg/g）。

2.4 動(dòng)物模型的建立及血漿樣品的采集

30只豚鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分成 3 組，即空白組、模型組和射干提取物組，每組10只。除空白組外，將其余2組豚鼠每日放入自制熏籠中煙熏30 min，連續(xù)7 d，分別在第2、3天用乙醚淺麻醉，然后鼻腔滴入合胞病毒液[13]。射干提取物組豚鼠于第8天灌胃給予射干提取物10 mg/kg（以野鳶尾黃素計(jì)）[13]，空白組和模型組豚鼠給予相同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥7 d后腹主動(dòng)脈采血，以1 370×g離心10 min，分離血漿，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 血漿樣品的處理

采用CPE法進(jìn)行血漿樣品處理。精密吸取100 μL血漿樣品于1.5 mL空白離心管中，加入吲哚美辛內(nèi)標(biāo)溶液10 μL、甲醇-水（50 ∶ 50，V/V）10 μL、Triton X-114溶液150 μL和一定濃度的鹽酸溶液適量，渦旋混勻5 min，水浴環(huán)境中一定溫度下平衡一定時(shí)間后，取出，以1 370×g離心5 min，棄去水相，向表面活性劑層中加入乙腈100 μL，渦旋混勻，以13 148×g離心5 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.6 血漿樣品CPE法的條件優(yōu)選

CPE過(guò)程主要受表面活性劑的濃度、樣品酸堿度、平衡溫度和平衡時(shí)間的影響[2]。因此，本研究分別考察上述4個(gè)因素對(duì)LTB4提取回收率的影響，優(yōu)化樣品CPE處理方法。提取回收率計(jì)算公式為：LTB4提取回收率（%）=CPE樣品中LTB4與吲哚美辛的峰面積比/純?nèi)芤褐蠰TB4與吲哚美辛的峰面積比×100%。

2.6.1 Triton X-114濃度的考察 在CPE過(guò)程中，固定鹽酸的濃度為0.3 mol/L、加入量40 μL，平衡溫度為50 ℃，平衡時(shí)間為30 min，分別采用濃度為1%、3%、5%、7%、9%的Triton X-114進(jìn)行血漿樣品的替代基質(zhì)（44.5 g/L的牛血清白蛋白生理鹽水溶液）[14]處理。結(jié)果表明，當(dāng)Triton X-114濃度從1%增加到5%時(shí)，LTB4的提取回收率逐漸增加且趨于平穩(wěn)，綜合考慮表面活性劑用量可能對(duì)質(zhì)譜的影響，確定Triton X-114濃度為5%。Triton X-114濃度對(duì)LTB4提取回收率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1A。

2.6.2 樣品酸堿度的考察 在CPE過(guò)程中，固定Triton X-114濃度為5%，平衡溫度為50 ℃，平衡時(shí)間為30 min，分別考察鹽酸的濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）（固定鹽酸加入量為40 μL）和加入量（20、30、40、50、60 μL）（固定鹽酸濃度為0.3 mol/L）對(duì)LTB4提取回收率的影響。結(jié)果表明，LTB4的提取回收率隨鹽酸濃度的增加而增加，當(dāng)鹽酸濃度為0.3 mol/L時(shí)LTB4提取回收率最大，繼續(xù)加大鹽酸濃度LTB4提取回收率反而下降；LTB4的提取回收率隨著鹽酸加入量的增加而增加，加入50 μL 鹽酸 時(shí)LTB4提取回收率最大，繼續(xù)加大鹽酸用量時(shí)LTB4提取回收率下降。故確定加入鹽酸濃度為0.3 mol/L，加入量為50 μL。樣品酸堿度對(duì)LTB4提取回收率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1B、C。

2.6.3 平衡溫度 在CPE過(guò)程中，固定Triton X-114濃度為5%，鹽酸的濃度為0.3 mol/L、加入量為50 μL，平衡時(shí)間為30 min，分別考察平衡溫度（40、45、50、55、60 ℃）對(duì)LTB4提取回收率的影響。結(jié)果表明，LTB4提取回收率隨溫度的升高而增加，平衡溫度為50 ℃時(shí)，LTB4提取回收率最大，繼續(xù)升高溫度LTB4提取回收率不再增加，故確定平衡溫度為50 ℃。平衡溫度對(duì)LTB4提取回收率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1D。

2.6.4 平衡時(shí)間 在CPE過(guò)程中，固定Triton X-114濃度為5%，鹽酸濃度為0.3 mol/L、加入量為50 μL，平衡溫度為50 ℃，分別考察平衡時(shí)間（10、15、20、25、30 min）對(duì)LTB4提取回收率的影響。結(jié)果表明，平衡20 min可使樣品中LTB4的提取回收率達(dá)到最大值，延長(zhǎng)平衡時(shí)間LTB4提取回收率不再增加，故確定平衡時(shí)間為20 min。平衡時(shí)間對(duì)LTB4提取回收率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1E。

2.7 分析方法驗(yàn)證

2.7.1 專(zhuān)屬性 精密量取100 μL空白血漿的替代基質(zhì)，不加內(nèi)標(biāo)；200 μg/L的LTB4對(duì)照品溶液10 μL，氮?dú)庀麓蹈?，加?00 μL空白血漿的替代基質(zhì)；豚鼠給藥后收集的血漿樣品。根據(jù)“2.6”優(yōu)化條件，將以上樣品分別按“2.5”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，LTB4、內(nèi)標(biāo)吲哚美辛與內(nèi)源性物質(zhì)分離良好，保留時(shí)間分別為2.52、2.78 min，各相鄰峰間分離度均大于1.5，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾LTB4和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2。

2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 分別精密量取LTB4系列對(duì)照品溶液10 μL于1.5 mL空白離心管中，加入空白血漿的替代基質(zhì)，制備成LTB4血漿濃度分別為1、5、10、20、50、100 μg/L的樣品，根據(jù)“2.6”優(yōu)化的條件按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理，然后按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。以LTB4與內(nèi)標(biāo)吲哚美辛峰面積的比為縱坐標(biāo)（y）、樣品濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.054x-0.008（r=0.999 0）。結(jié)果表明，LTB4血藥濃度在1～100 μg/L范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.7.3 準(zhǔn)確度和精密度 分別配制LTB4血漿質(zhì)量濃度為2、25、80 μg/L的QC樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行6樣品分析，根據(jù)“2.6”優(yōu)化的條件按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理，然后按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，共進(jìn)行3批次分析，計(jì)算批內(nèi)、批間精密度[以變異系數(shù)（CV）表示]和準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，2、25、80 μg/L QC樣品的批內(nèi)和批間精密度以及準(zhǔn)確度結(jié)果均符合生物樣品分析要求。準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.7.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 分別精密量取LTB4質(zhì)控用對(duì)照品溶液10 μL于1.5 mL空白離心管中，加入空白血漿的替代基質(zhì)，制備LTB4質(zhì)量濃度為2、25、80 μg/L的血漿替代基質(zhì)樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理；分別精密量取LTB4質(zhì)控用對(duì)照品溶液10 μL于1.5 mL空白離心管中，氮?dú)庀麓蹈桑尤胍译?00 μL，混勻即得對(duì)照品溶液；另分別精密量取空白血漿的替代基質(zhì)100 μL，不加內(nèi)標(biāo)，按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理，在處理后上清液中分別加入10 μL質(zhì)控用對(duì)照品溶液和10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻即得基質(zhì)樣品。每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行3樣品分析，計(jì)算LTB4的提取回收率和內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，2、25、80 μg/L 3個(gè)質(zhì)量濃度下LTB4的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)均符合生物樣品分析要求。提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.7.5 穩(wěn)定性 分別制備LTB4質(zhì)量濃度為2、80 μg/L的QC樣品，考察QC樣品在室溫放置4 h、自動(dòng)進(jìn)樣器中（4 ℃）中放置24 h、經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)和-70 ℃放置90 d的穩(wěn)定性，每個(gè)濃度進(jìn)行3樣品分析。結(jié)果表明，QC樣品在上述條件下均穩(wěn)定，不同條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.8 豚鼠血漿中LTB4的濃度測(cè)定

采用UPLC-MS/MS法測(cè)得空白組、模型組和射干提取物組豚鼠血漿中LTB4的質(zhì)量濃度分別為（1 078.23±12.54）、（1 136.25±11.59）、（1 085.36±10.91）ng/L。采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果表明，與空白組比較，模型組豚鼠血漿中LTB4濃度顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，射干提取物組豚鼠血漿中LTB4濃度顯著降低（P<0.05），且與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。表明造模后氣道炎癥豚鼠血漿中LTB4濃度升高，給予射干提取物后血漿中LTB4濃度上升。

3 討論

濁點(diǎn)是非離子表面活性劑的特性，即隨溫度的升高表面活性劑均相膠束溶液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象時(shí)的溫度。CPF過(guò)程中常用的非離子表面活性劑有Triton X-114、Triton X-100、聚山梨酯20和聚山梨酯80，其濁點(diǎn)分別為23、64、95和85 ℃。由于CPF平衡溫度需高于濁點(diǎn)15～20 ℃[15]，而Triton X-114的濁點(diǎn)溫度顯著低于其他表面活性劑，兼顧生物樣品高溫下的不穩(wěn)定性，故本研究最終選擇Triton X-114為表明活性劑對(duì)生物樣品進(jìn)行萃取。LTB4為弱酸性物質(zhì)，采用鹽酸調(diào)節(jié)樣品的pH值至弱酸性，既保證了LTB4以分子狀態(tài)被包封于表面活性劑膠束的疏水核內(nèi)部，又有助于提高LTB4的提取回收率。但是當(dāng)鹽酸加入量過(guò)大時(shí)，由于離子抑制效應(yīng)，LTB4提取回收率反而下降。采用CPF進(jìn)行生物樣品前處理，相比于傳統(tǒng)的蛋白沉淀法、液液萃取法、固液萃取法、液相微萃取、固相微萃取等方法，節(jié)約了有機(jī)試劑的用量、提高了萃取富集效率、降低了分析成本，充分體現(xiàn)了“綠色環(huán)?！钡睦砟?。

花生四烯酸是一種ω-6多不飽和脂肪酸，分別在環(huán)氧合酶、脂氧酶及細(xì)胞色素單氧化酶作用下代謝為一系列的代謝產(chǎn)物，為重要的炎癥介導(dǎo)因子[16]。LTB4是花生四烯酸脂氧酶途徑的代謝產(chǎn)物，炎癥反應(yīng)時(shí)體內(nèi)濃度顯著上調(diào)，建立靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)的UPLC-MS/MS方法監(jiān)測(cè)血漿中LTB4濃度，可為炎癥診治提供數(shù)據(jù)依據(jù)。LTB4作為體內(nèi)內(nèi)源性生物標(biāo)記物，無(wú)法得到空白生物樣品。因此，本研究制備了44.5 g/L的牛血清白蛋白生理鹽水溶液作為血漿替代基質(zhì)進(jìn)行UPLC-MS/MS方法驗(yàn)證。建立的含量測(cè)定方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，LTB4提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)均符合生物樣品分析要求，可用于LTB4的準(zhǔn)確定量分析。本研究結(jié)果顯示，氣道炎癥模型豚鼠血漿中LTB4濃度顯著升高，而給予射干提取物后血漿中LTB4濃度顯著回調(diào)，且接近正常水平。這提示，射干提取物抗炎、止咳的作用機(jī)制可能與降低血漿中異常升高的LTB4濃度有關(guān)。

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（收稿日期：2018-01-05 修回日期：2018-04-20）

（編輯：林 靜）