滴水珠珠芽發(fā)育過程研究

朱燕燕 羅睿 陳海麗 劉丹

摘 要： 珠芽是滴水珠（Pinellia cordata）的營養(yǎng)繁殖結(jié)構(gòu)，為揭示滴水珠珠芽發(fā)育過程中的特征，該研究以野外采集材料進行盆栽觀察試驗，通過形態(tài)觀察法和石蠟切片方法，探索滴水珠葉片和葉柄處珠芽發(fā)育過程中的形態(tài)學和解剖學結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明：滴水珠珠芽發(fā)育過程在形態(tài)上分為葉柄無現(xiàn)象時期、早期珠芽結(jié)構(gòu)分化和珠芽膨大成熟時期三個時期；相應的解剖學發(fā)育時期為珠芽原基啟動期和形成期、原基分化期和膨大成熟期四個階段。葉片和葉柄珠芽起始細胞均由葉柄腹面表皮下層薄壁細胞組織脫分化形成，起始細胞不斷分裂形成細胞團最后發(fā)育成珠芽原基；在原基分化期的特征是生長點形成，最終分化形成芽原基和鱗片葉；膨大成熟期的特征是珠芽結(jié)構(gòu)不斷生長，生長點側(cè)生分化鱗片葉增多。葉片和葉柄處珠芽成熟脫落時期為灰色橢圓形結(jié)構(gòu)，測得平均直徑分別為（2.79 ± 0.40）mm和（2.69 ± 0.36）mm，外部有鱗片包裹，內(nèi)部含大量營養(yǎng)物質(zhì)。在環(huán)境適宜條件下，珠芽遇土萌發(fā)，萌發(fā)率達75%。這表明滴水珠珠芽與同屬植物半夏珠芽發(fā)育過程差別不大，都是無性克隆營養(yǎng)繁殖體結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞： 珠芽， 發(fā)育過程， 形態(tài)特征， 解剖結(jié)構(gòu)， 滴水珠

中圖分類號： Q945.4

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2018）02-0225-08

Bulbil development of Pinellia cordata

ZHU Yanyan， LUO Rui*， CHEN Haili， LIU Dan

（ College of Life Sciences， Guizhou University， Guiyang 550025， China ）

Abstract： Tuber of Pinellia cordata has been the extensively used as medicines in the practice of traditional Chinese medicine. Bulbil formation is the main propagation strategy of P. cordata in wild. There are two developmental stages of bulbils for each one individual： on the basis of leaf blade （upper bulbil） and on the lower part of petiole （lower bulbil）. To reveal the developmental characteristics of bulbil formation in P. cordata， morphological and anatomical observation were systematically used. Morphological observation showed that the whole development process of upper or lower bulbil could be divided three stages： no visible bulbil structure， primary bulbil formation under epidermis， growth and maturation of bulbil. Correspondingly， anatomical observation showed that the whole development process of upper or lower bulbil could be divided four stages： initial cell formation， bulbil promodia formation， differentiation of bulbil， and bulbil growth continuously to maturation. The initial cell of bulbil was derived or dedifferentiated from the parenchyma cell which was located in the adaxial side of young petiole. Initial cell formation was not visible. Continuously division of the initial parenchyma cell resulted in the formation of bulbil primodium， which was a group of undifferentiated cell. The primordium continuously growth and then differentiated to form the shoot apical meristem （SAM）， which was the infant bulbil on the adaxial side. Bulbil promodium formation and early primodium differentiation could be visible with white dot structure on petiole. Subsequently， differentiated bulbil growth and lateral scale leaf differentiation continuously characterized the bulbil growth stage. Bulbil growth terminated with the leaf senescence. The average diameter of maturated upper bulbil on blade and lower bulbil on petiole were （2.79 ± 0.40） mm and （2.69 ± 0.36） mm， respectively. The maturated bulbils generally were gray and ellipsoidal， and shaped with various number of external scale leaf. The inner cells of maturated bulbil contained lots of nutrients （storage）. The germination rate of bulbils was up to 75% in soil culture. Morphological and anatomical observation results indicate that the development of bulbils in P. cordata is the same in P. ternata， and the development of bulbil in P. cordata is an effective reproduction strategy just like in P. ternata.

Key words： bulbil， development process， morphological characteristis， anatomical structure， Pinellia cordata

滴水珠（Pinellia cordata）是中國特有的一種天南星科（Araceae）半夏屬植物，主要分布于浙江、廣西等地（俞德浚，1979），在林下溪旁、潮濕草地及巖石邊等自然環(huán)境中生長。其塊莖主治毒蛇咬傷（田莎莎等，2013），在臨床上常用于腫瘤病人的消腫止痛（宋立人，2001），合成的凝集素顯示出明顯的抗蟲性（Lin et al，2008）。據(jù)報道其塊莖含多種氨基酸（徐照輝等，2004），生物堿以及具有明顯降低血清膽固醇功效的β-谷甾醇等物質(zhì)（樓之岑和秦波，2003），塊莖生品和炮制品中可分離得到6種不同的化合物（王琦等，2009），包含具有抑制霍亂弧菌、抗腫瘤等作用的吲哚類生物堿Neoechinulin A。

植物的珠芽，又叫零余子、小塊莖、鱗莖等（謝得镕等，1994；龍雯虹和郭華春，2006），因貯藏豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，形態(tài)肥大，可食用，含有多種營養(yǎng)及藥用成分，許多藥用植物珠芽都因此可入藥，包括《中華藥典》中記載的半夏珠芽。目前已有學者對幾種不同植物珠芽發(fā)育的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行了研究，包括薯蕷屬（山藥）（Murty & Purnima，1983；謝德镕等，1993；張儀等，1994）、淡黃花百合（李騰等，2012）、Titanotrichum （Gesneriaceae）（Wang & Cronk，2003）、四種Allium （Amaryllidacease）的珠芽比較（Choi et al，2011）、半夏珠芽（羅睿等，2014）等。在自然條件下，半夏屬植物多為一葉零珠芽或一葉一珠芽，而滴水珠比較獨特，一葉兩珠芽。目前對滴水珠珠芽的研究很少，有關(guān)珠芽的發(fā)育過程尚不明確。因此，該文通過觀察滴水珠珠芽發(fā)育的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)特征，深入了解滴水珠珠芽結(jié)構(gòu)，分析討論與其他植物珠芽發(fā)育過程的異同，可為進一步研究滴水珠珠芽發(fā)育的分子機制提供參考，并為滴水珠的生產(chǎn)和臨床用藥以及資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

滴水珠植株采集于浙江省溫州市永嘉縣，盆栽種植于貴州大學植物生理實驗室備用。從種下塊莖開始，每天定時觀察塊莖萌發(fā)出土及植株生長狀況，并取不同發(fā)育時期珠芽的葉柄段（約1 cm）和葉片基部材料，蒸餾水沖洗后，放入裝有FAA固定液的青霉素瓶中，真空泵抽氣30～60 min后，加蓋固定24 h以上。采用番紅-固綠染色法進行染色，并用中性樹膠封片，在光學顯微鏡OLMPUS BX 53下觀察結(jié)構(gòu)并用顯微鏡自帶的拍照系統(tǒng)采集圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 滴水珠珠芽的形態(tài)發(fā)育特征

滴水珠塊莖在3月中旬（依據(jù)每年具體氣溫變化） 氣溫回升到15 ℃以上時開始恢復活動， 塊莖上部的頂芽中幼葉生長突破表皮，頂芽基部產(chǎn)生不定根（圖1：a）。蜷曲的葉在3月底4月初出土，其葉柄靠近土壤表面處可觀察到透光率較低的部位（圖1：b），此時撥開蜷曲的葉片，未發(fā)現(xiàn)珠芽的形成（圖2：a）。葉柄透光率較低的部位在3～7 d后慢慢成深于葉柄顏色的點狀結(jié)構(gòu)（圖1：c），而此時的葉片已展開，未觀察到葉片基部有珠芽形成。經(jīng)過一周的生長，葉柄處點狀結(jié)構(gòu)變成淺綠色凸起狀結(jié)構(gòu)（圖1：d），此時葉片基部出現(xiàn)白色點狀結(jié)構(gòu)（圖2：b）。葉柄處凸起結(jié)構(gòu)在經(jīng)過7 d左右生長可轉(zhuǎn)變?yōu)樵缙谥檠拷Y(jié)構(gòu)（圖1：e），而葉片基部珠芽由白色變化為綠色點狀結(jié)構(gòu)（圖2：c），且發(fā)育成早期珠芽結(jié)構(gòu)（圖2：d）。葉柄處早期凸起珠芽結(jié)構(gòu)在8 d左右開始突破單側(cè)表皮結(jié)構(gòu)并形成頂端生長點（圖1：f， g），此時葉片基部珠芽逐漸膨大（圖2：e），且有頂部生長點形成，顏色有淺綠色變成深綠色斑點狀（圖2：f）。葉柄珠芽經(jīng)歷14 d左右時間完全突破葉柄表皮，成為深綠色斑狀結(jié)構(gòu)珠芽（圖1：h），測得其珠芽平均直徑為（1.85±0.22）mm；而葉片珠芽迅速膨大，顏色變成深綠色，形狀為上尖下圓狀，有鱗片狀包被結(jié)構(gòu)形成（圖2：g， h），測得其珠芽平均直徑為（1.80±0.23）mm；葉柄珠芽經(jīng)過14 d左右，逐漸成熟，珠芽外表皮變成灰色鱗片狀結(jié)構(gòu)形成（圖1：i， j），測得其珠芽平均直徑為（2.79 ± 0.40）mm；葉片處珠芽外表皮也由深綠色變成灰色，測得其珠芽平均直徑為（2.69 ± 0.36）mm，逐漸成熟（圖2：i-k）。葉柄和葉片珠芽在經(jīng)歷一到兩個月時間的生長，繼續(xù)發(fā)育直至成熟（圖1：k；圖2：l），珠芽脫落后，遇土可直接萌發(fā)形成新的植株（圖1：l）。

2.2 珠芽不同發(fā)育時期的解剖結(jié)構(gòu)

滴水珠剛出土未見任何珠芽跡象時，對葉柄進行橫切，發(fā)現(xiàn)其構(gòu)成成分包括規(guī)則的外表皮細胞、薄壁細胞組織、環(huán)狀維管束等。表皮細胞會逐漸分化形成角質(zhì)細胞，最外圈維管束外圍部分薄壁細胞的細胞壁進行不均勻的增厚成為葉柄的主要組織，即厚角組織，導致葉柄表面形成凸起（圖3：A， B）。肉眼可見葉柄內(nèi)透光率較低的部位（圖1：b）轉(zhuǎn)變?yōu)槿庋劭梢姇r期（圖1：c），解剖學觀察發(fā)現(xiàn)，表皮下的維管束外圍薄壁細胞（圖3：C）為珠芽原基啟動細胞，隨后進行垂周分裂和平周分裂增加細胞數(shù)形成細胞團；表皮下細胞同其下的薄壁細胞間存在明顯的間隙，隨后發(fā)育成為表皮衍生結(jié)構(gòu)，而間隙內(nèi)部的薄壁細胞會發(fā)育形成珠芽原基的表皮細胞（圖3：C-F）。形態(tài)學上的珠芽凸起階段（圖1：d， e），解剖學觀察表明：珠芽原基處細胞濃密，生長過程中細胞層數(shù)不斷增加，最終突破表皮衍生結(jié)構(gòu)的包圍（圖3：G， H），并且原基突出部分有生長點生成，間隙外圍較大的細胞最后會發(fā)育成珠芽的鱗片結(jié)構(gòu)（圖3：H）。形態(tài)學上的珠芽逐漸突破葉柄表皮時期（圖1：f-h），解剖學觀察表明：珠芽原基內(nèi)部生長點形成頂端分生組織，頂端分生組織逐漸分化形成1～2片鱗片葉以及葉原基（圖3：I）；隨著珠芽原基膨大，體積不斷增大（圖3：J）。葉片衰老（倒苗）時期的珠芽（圖1：k），其切片結(jié)果顯示：珠芽頂端有一團原生質(zhì)很濃的細胞，為芽生長錐（圖3：K），珠芽具備芽的特征，基內(nèi)具有3～4幼葉及托葉梢結(jié)構(gòu)（圖3：L），含有大量的貯藏物。

滴水珠塊莖萌發(fā)出土后，肉眼觀察卷葉期葉片基部無白點形成（圖2：a），取材進行切片觀察發(fā)現(xiàn)：與葉片相連的葉柄內(nèi)部7～9層細胞處為珠芽原基啟動細胞，相較于周邊細胞較小且分布密集（圖4：A），表皮下的細胞層數(shù)增加，逐漸分裂形成細胞團（圖4：B），細胞團中細胞分布密集，細胞質(zhì)濃密，形成珠芽原基（圖4：C）。當在葉片基部肉眼觀察到白點向綠點發(fā)展時（圖2：b），解剖觀察發(fā)現(xiàn)，珠芽原基逐漸發(fā)育，體積增大，凸出葉基部（圖4：D），內(nèi)部逐步形成維管組織，頂端部分細胞小且濃密，分布密集（圖4：E， F）。珠芽慢慢膨大形成橢球型結(jié)構(gòu)時（圖2：d），切片觀察知，珠芽在膨大發(fā)育過程中，外圍1～3層較大的細胞后期會發(fā)育形成鱗片結(jié)構(gòu)，其頂端細胞分布密集且體積小（圖4：G），隨后發(fā)育形成頂端分生組織（圖4：H），并分化形成鱗片葉和葉原基（圖4：I）。隨葉片衰老珠芽衰落（圖2：i），切片發(fā)現(xiàn)珠芽具備芽的特征，基內(nèi)具有3～4幼葉及托葉梢結(jié)構(gòu)（圖4：J），外圍的薄壁細胞相對較大，細胞空隙較大（圖4：K），珠芽內(nèi)部薄壁細胞組織含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)（圖4：L）。

3 討論與結(jié)論

滴水珠珠芽發(fā)育位置在葉片基部和葉柄下部，與半夏僅在葉柄下部發(fā)育不同，但其發(fā)育過程在形態(tài)上可分為葉柄無現(xiàn)象、早期珠芽結(jié)構(gòu)分化和珠芽膨大成熟三個時期，在相應的解剖學上可分為珠芽原基啟動期和形成期、原基分化期和膨大成熟期四個階段，其發(fā)育過程與半夏珠芽發(fā)育類似（羅睿等，2014）。滴水珠珠芽也是一種營養(yǎng)芽性質(zhì)的克隆繁殖結(jié)構(gòu)，不具有胚結(jié)構(gòu)，成熟珠芽內(nèi)部含有大量晶體、淀粉等內(nèi)含物（晏升祿等，2012；羅睿等，2014）。

滴水珠在葉柄下部和葉片基部均有珠芽形成，葉柄處的成熟珠芽與葉片處珠芽大小相近，而與半夏相比，會發(fā)現(xiàn)其成熟珠芽平均直徑是半夏珠芽（0.72 ± 0.14）cm（孫瑩瑩，2016）的三分之一。這顯示半夏珠芽繁殖趨向于k選擇，而滴水珠珠芽繁殖更趨向于r選擇。觀察滴水珠發(fā)現(xiàn)，當年生珠芽在環(huán)境適宜條件下，遇土即萌發(fā)，且萌發(fā)率高達75%，可見滴水珠在一定程度上也可以稱之為雜草型中草藥。這點不同于山藥零余子（龍雯虹等，2011），有明顯的休眠期，萌發(fā)需打破休眠期，滴水珠珠芽從成熟到萌發(fā)無明顯的休眠特征，在散生條件下可有效擴大自然種群，大大增加無性繁殖的成功率。

滴水珠葉片和葉柄珠芽原基均起源于葉柄維管束外圍的薄壁細胞，珠芽發(fā)育過程分為四個時期，與半夏葉柄珠芽發(fā)育過程類似，但滴水珠葉柄珠芽在形態(tài)上為凸起結(jié)構(gòu)時，觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)已分化出頂芽，與山藥珠芽發(fā)育相類似（謝德镕等，1993；張儀等，1994）；珠芽成熟期觀察結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其上部有托葉及托葉鞘結(jié)構(gòu)，內(nèi)部含生長錐，下部薄壁細胞含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，與較強貯藏功能有關(guān)，與珠芽蓼珠芽解剖結(jié)構(gòu)類似（李有忠和沈頌東，1996）。滴水珠葉柄處珠芽結(jié)構(gòu)發(fā)育過程對應各時期的形態(tài)特征為形態(tài)結(jié)構(gòu)無變化、透明到淡綠色點狀、凸起珠芽、膨大突破表皮、珠芽成熟脫落到珠芽萌發(fā)，葉片珠芽發(fā)育過程形態(tài)特征為形態(tài)結(jié)構(gòu)無變化、白色到綠色點狀、早期凸起珠芽結(jié)構(gòu)、珠芽膨大、珠芽成熟脫落到珠芽萌發(fā)，與半夏的珠芽形態(tài)特征相類似。珠芽與淡黃花百合珠芽（李騰等，2012）一樣，有明顯的成熟期，會在外力作用下脫落。

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