續(xù)斷飲片標(biāo)準(zhǔn)湯中川續(xù)斷皂苷Ⅵ轉(zhuǎn)移率的研究

李軍山 常云鳳 馬浩 牛麗穎 李振江

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）20-2782-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.10

摘 要 目的：研究續(xù)斷飲片標(biāo)準(zhǔn)湯中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)移率。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定續(xù)斷飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，色譜柱為SinoChrom ODS-AP，流動(dòng)相為乙腈-水（30 ∶ 70，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為212 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。根據(jù)成分含量測(cè)定結(jié)果計(jì)算從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯轉(zhuǎn)變過(guò)程中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果：川續(xù)斷皂苷Ⅵ檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.484～4.84 μg（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%；定量限、檢測(cè)限分別為0.3、0.1 μg；飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯中的加樣回收率分別為95.13%～100.22%（RSD=1.78%，n=6）、97.07%～100.08%（RSD=0.98%，n=6）；耐用性試驗(yàn)的RSD均小于1%。續(xù)斷飲片標(biāo)準(zhǔn)湯中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)移率為26.3%～49.5%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性好，可用于續(xù)斷飲片標(biāo)準(zhǔn)湯中川續(xù)斷皂苷Ⅵ轉(zhuǎn)移率的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 續(xù)斷；飲片；標(biāo)準(zhǔn)湯；高效液相色譜法；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；轉(zhuǎn)移率

ABSTRACT OBJECTIVE： To study transfer rate of asperosaponinⅥ in standard decoction of Dipsacus asper decoction pieces. METHODS： The content of asperosaponin Ⅵ in Dipsacus asper decoction pieces and its standard decoction was determined by HPLC. The determination was performed on SinoChrom ODS-AP with mobile phase consisted of acetonitrile-water （30 ∶ 70，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 212 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. By the ingredients content obtained， the transfer rate of asperosaponin Ⅵ was calculated during decoction piece to standard decoction. RESULTS： The linear range of asperosaponin Ⅵ was 0.484-4.84 μg（r=0.999 9）. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The limits of quantification and detection were 0.3 and 0.1 μg， respectively. The average recoveries in D. asper decoction pieces and standard decoction were 95.13%-100.22%（RSD=1.78%，n=6），97.07%-100.08%（RSD=0.98%，n=6）. RSD of durability test was lower than 1%.The transfer rate of asperosaponin Ⅵ in standard decoction of D. asper decoction pieces ranged 26.3%-49.5%. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， precise， stable， reproducible and durable， and can be used for transfer rate of asperosaponin Ⅵ in standard decoction of D. asper decoction pieces.

KEYWORDSD Dipsacus asper； Decoction pieces； Standard decoction； HPLC； Asperosaponin Ⅵ； Transfer rate

續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷（Dipsacus asper Wall. ex Henry）的干燥根，收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，主產(chǎn)于四川、云南等地，其性苦、辛，微溫[2]。續(xù)斷的主要成分是三萜皂苷類成分，其中含量最高的為川續(xù)斷皂苷Ⅵ；此外還有茶茱萸苷、熊果酸等環(huán)烯醚萜類成分以及龍膽堿、喜樹堿等生物堿類成分[3]。研究顯示，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)非酒精性脂肪肝模型小鼠具有明顯的降脂作用[4]。

中藥配方顆粒（即本文中“標(biāo)準(zhǔn)湯”）是由單味中藥飲片煎煮后經(jīng)提取濃縮制成的供中醫(yī)臨床配方使用的顆粒，是近幾年市場(chǎng)需求增長(zhǎng)迅速的產(chǎn)品，但存在著標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等問(wèn)題，給臨床用藥帶來(lái)諸多不穩(wěn)定因素[5]。本研究參照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》，收集15 批不同產(chǎn)地的續(xù)斷藥材飲片，制備成標(biāo)準(zhǔn)湯，并測(cè)定川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，以此計(jì)算從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯轉(zhuǎn)變過(guò)程中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)移率，從而為續(xù)斷飲片標(biāo)準(zhǔn)湯的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-15C型高效液相色譜（HPLC）儀，包括SPD-15C紫外-可見檢測(cè)器等（日本Shimadzu公司）；Shunliu-12N型冷凍干燥機(jī)（南京順流儀器有限公司）；2XZ-4型旋片式真空泵（臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司）；AE 240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KH-3200 E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111685-201506，純度：90.2%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

筆者收集得到不同產(chǎn)地的15批續(xù)斷藥材飲片（詳見表1），并經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶慧教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-AP（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（30 ∶ 70，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：212 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶液制成川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量濃度為242 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 飲片供試品溶液 精密稱取飲片樣品細(xì)粉0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理10 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)湯供試品溶液 稱取飲片樣品100 g，加水煎煮2次。第一次加水900 mL，浸泡30 min，沸后煎煮60 min；第二次加水700 mL，沸后煎煮40 min。合并兩次煎液，經(jīng)300目篩網(wǎng)趁熱濾過(guò)，取續(xù)濾液，真空濃縮（溫度<65 ℃，真空度≥0.09 MPa），冷凍干燥后精密稱取0.5 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯供試品溶液[6-7]。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液 以70%甲醇溶液作為陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)按川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰計(jì)均不低于3 000；基線分離良好，分離度均大于1.5。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，陰性對(duì)照在與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，表明本方法專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2、6、12、16、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以川續(xù)斷皂苷Ⅵ進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=2.338 3×105x+5.200 4×103（r=0.999 9）。結(jié)果表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.484～4.84 μg。

2.6 定量限與檢測(cè)限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，川續(xù)斷皂苷Ⅵ定量限、檢測(cè)限分別為0.3、0.1 μg。

2.7 儀器精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積的RSD為0.61%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8 中間精密度試驗(yàn)

由2名分析員分別在不同日期精密稱取飲片樣品（批號(hào)：1609032）細(xì)粉適量，分別按“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在不同儀器上進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2、表3。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：1609032）、“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：1609032）適量，于室溫下放置0、2、4、6、8、12、18 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯供試品溶液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積的RSD分別為0.74%、0.60%（n=7），表明兩種供試品溶液在室溫下放置18 h內(nèi)均基本穩(wěn)定。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取飲片樣品（批號(hào)：1609032）細(xì)粉適量，分別按“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯供試品溶液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量平均值分別為6.20%、6.75%，RSD分別為1.56%、1.15%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量飲片樣品（批號(hào)：1609032）細(xì)粉適量，共12份，分別加入一定質(zhì)量濃度的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

2.12 耐用性試驗(yàn)

2.12.1 色譜柱考察 精密稱取飲片樣品（批號(hào)：1610111）細(xì)粉適量，分別按“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件[色譜柱分別設(shè)置為SinoChrom ODS-AP（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，色譜柱發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.12.2 流動(dòng)相考察 精密稱取飲片樣品（批號(hào)：1610111）細(xì)粉適量，分別按“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（流動(dòng)相乙腈與水體積比分別設(shè)置為25 ∶ 75、30 ∶ 70、35 ∶ 65）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，流動(dòng)相發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.12.3 流速考察 精密稱取飲片樣品（批號(hào)：1610111）細(xì)粉適量，分別按“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（流速分別設(shè)置為0.8、1.0、1.2 mL/min）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，流速發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.12.4 柱溫考察 精密稱取飲片樣品（批號(hào)：1610111）細(xì)粉適量，分別按“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（柱溫分別設(shè)置為25、30、35 ℃）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，柱溫發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.13 樣品含量測(cè)定及轉(zhuǎn)移率計(jì)算

取15批飲片樣品細(xì)粉各適量，分別按“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積計(jì)算樣品含量，并計(jì)算從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯轉(zhuǎn)變過(guò)程中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)移率（出膏率=膏體質(zhì)量/飲片質(zhì)量×100%；轉(zhuǎn)移率=標(biāo)準(zhǔn)湯中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量×出膏率/飲片中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量×100%），結(jié)果見表6。

3 討論

川續(xù)斷皂苷Ⅵ作為續(xù)斷藥材飲片的主要成分，是評(píng)價(jià)續(xù)斷藥材飲片質(zhì)量的重要指標(biāo)；續(xù)斷飲片標(biāo)準(zhǔn)湯是續(xù)斷藥材飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥制成，因此，川續(xù)斷皂苷Ⅵ同樣是續(xù)斷飲片標(biāo)準(zhǔn)湯的指標(biāo)成分。本研究結(jié)果顯示，以飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯轉(zhuǎn)變過(guò)程中川續(xù)斷皂苷Ⅵ轉(zhuǎn)移率為26.3%～49.5%，均值為37.7%。若以川續(xù)斷皂苷Ⅵ轉(zhuǎn)移率均值的70%～140%[8-9]作為限定范圍（26.4%～52.8%）進(jìn)行評(píng)判，本次15批續(xù)斷飲片標(biāo)準(zhǔn)湯中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)移率均符合要求。

預(yù)試驗(yàn)中，筆者先后采用冷凍干燥、60 ℃真空干燥和100 ℃干燥3種方式干燥標(biāo)準(zhǔn)湯，結(jié)果顯示，冷凍干燥和60 ℃真空干燥后膏粉含量變化不大；而100 ℃干燥所得膏粉含量顯著下降?？紤]到試驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性，故選擇冷凍干燥。筆者又先后考察了第一次煎煮加水量為7、9、11倍，第二次煎煮加水量為6、7、8倍時(shí)川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果顯示，適度增加水量，標(biāo)準(zhǔn)湯中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)移率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。最終確定正式試驗(yàn)第一次煎煮加水量為9倍，第二次煎煮加水量為7倍。筆者還先后考察了第一次煎煮30、40、50、60 min，第二次煎煮20、30、40、50 min時(shí)川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果顯示，適度延長(zhǎng)煎煮時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)湯中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)移率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。最終確定正式試驗(yàn)第一次煎煮60 min，第二次煎煮40 min。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性好，可用于續(xù)斷飲片標(biāo)準(zhǔn)湯中川續(xù)斷皂苷Ⅵ轉(zhuǎn)移率的測(cè)定。

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（收稿日期：2018-01-03 修回日期：2018-03-16）

（編輯：張 靜）