大戟苷誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制研究

張德莉 李曉強(qiáng) 白銀亮 何榮霞 呂銀鳳 文惠方 魏麗

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）20-2773-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.08

摘 要 目的：研究大戟苷對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。方法：取Hela細(xì)胞分為空白對(duì)照組、順鉑組（陽性對(duì)照，10 mg/L）和大戟苷低、中、高劑量組（50、100、200 mg/L），分別加入相應(yīng)藥物進(jìn)行培養(yǎng)。藥物作用24、48、72 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。藥物作用48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用Hoechst 33258染色法檢測(cè)細(xì)胞核的形態(tài)變化；采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞色素C（Cyt-C）、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，順鉑組和大戟苷各劑量組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05或P<0.01），細(xì)胞核濃染，或有變形、縮小、碎裂，或出現(xiàn)凋亡小體。與空白對(duì)照組比較，大戟苷低、中、高劑量組細(xì)胞中Cyt-C、Caspase-8和Caspase-9蛋白表達(dá)水平均顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平和Bcl-2/Bax比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；大戟苷中、高劑量組細(xì)胞中Bax、Caspase-3和Caspase-10蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：大戟苷能顯著抑制Hela細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用可能是通過激活Caspase依賴的線粒體凋亡途徑來實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 大戟苷；宮頸癌；Hela細(xì)胞；凋亡；機(jī)制

ABSTRACT OBJECTIVE： To study induction effect of euphornin on the apoptosis of cervical cancer Hela cells and its mechanism. METHODS： The cervical cancer Hela cells were divided into blank control group， cisplatin group （positive control， 10 mg/L） and euphornin low-dose， medium-dose and high-dose groups （50， 100， 200 mg/L）. They were treated with relevant medicine. The inhibitory effect of Hela cells proliferation was tested by MTT assay after 24， 48， 72 h of medicine treatment. The apoptotic rate of Hela cells was measured by flow cytometry after 48 h of medicine treatment. Morphology of nucleus was detected by Hoechst 33258 staining. The protein expression of Cyt-C，Bcl-2，Bax，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9 and Caspase-10 were detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with blank control group， inhibitory rate of cell proliferation and cell apoptosis rate were increased significantly in cisplatin group and euphornin groups （P<0.05 or P<0.01）， and obvious staining， deformation， shrinking， fragmentation or apoptotic bodies was found in nucleus. Compared with blank control group， the protein expression levels of Cyt-C， Caspase-8 and Caspase-9 in euphornin low-dose， medium-dose and high-dose groups were increased significantly， while the protein expression level of Bcl-2 and Bcl-2/Bax ratio were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； the protein expression levels of Bax，Caspase-3 and Caspase-10 in euphornin medium-dose and high-dose groups were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Euphornin can significantly inhibit the proliferation of Hela cell and promote cell apoptosis， the effect of which will be achieved by activating the Caspase-dependent mitochondrion apoptosis pathway.

KEYWORDS Euphornin；Cervical cancer；Hela cell；Apoptosis； Mechanism

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在全球女性腫瘤中居第3位，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。澤漆是大戟屬植物澤漆（Euphorbia helioscopia L.）的干燥全草，其作為民間驗(yàn)方的重要組成部分用于治療宮頸癌、食道癌等表現(xiàn)出一定療效，因此其抗腫瘤活性引起了研究者的廣泛關(guān)注[2-3]。近年來，有研究者對(duì)澤漆的不同溶劑提取物進(jìn)行了抗腫瘤活性篩選，發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制作用[2-4]。以往研究顯示，澤漆的乙酸乙酯、石油醚、氯仿等萃取液對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞、HepG2細(xì)胞，胃癌SGC7901細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞均有顯著的增殖抑制作用，其機(jī)制可能是通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5-8]。目前的研究大多是針對(duì)澤漆的提取混合物，對(duì)其單體活性成分的研究較少。只有Chen H等[9]于2012年首次研究了澤漆的二萜酯類單體活性成分之一大戟苷（Euphornin）的細(xì)胞毒作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)肺腺癌LA795細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，因此提出大戟苷是澤漆提取物發(fā)揮抗腫瘤作用的最關(guān)鍵組分之一，但并未對(duì)其抗腫瘤作用機(jī)制作進(jìn)一步研究。基于此，本課題組擬研究大戟苷誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制，為大戟苷臨床上用于宮頸癌的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

BB15型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）；Synergy H1型全功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；IX51型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；DYY-Ⅲ型電泳儀、DYY-Ⅲ型電泳槽（北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠）；Z216K型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hermle 公司）。

1.2 藥品與試劑

大戟苷（蘭州大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室，批號(hào)：20151121，純度：≥98%）；順鉑注射液（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：160508，規(guī)格：30 mg/6 mL）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、Hoechst 33258染色試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；鼠抗人細(xì)胞色素C（Cyt-C）、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10、β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠二抗（美國(guó)Santa Cruz公司）；BCA蛋白定量分析試劑盒、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、雙抗（青霉素-鏈霉素）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；水為雙蒸水。

1.3 細(xì)胞

人宮頸癌Hela細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取Hela細(xì)胞，在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“DMEM培養(yǎng)基”）中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)取出用于試驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)。將Hela細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h；將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、順鉑組（陽性對(duì)照）和大戟苷低、中、高劑量組，分別加入含相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基。根據(jù)文獻(xiàn)[9]，大戟苷低、中、高劑量組的藥物終質(zhì)量濃度分別為50、100、200 mg/L；順鉑組的藥物終質(zhì)量濃度為10 mg/L；空白對(duì)照組加入等體積的不含藥DMEM培養(yǎng)基。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。每組細(xì)胞均設(shè)6個(gè)復(fù)孔平行操作。培養(yǎng)完畢后收集細(xì)胞，以MTT染色液染色，采用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（OD值），計(jì)算大戟苷對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。將Hela細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h；按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及加入相應(yīng)藥物；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次；按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞核形態(tài)觀察

采用Hoechst 33258染色法檢測(cè)。按“2.3”項(xiàng)下方法取Hela細(xì)胞接種、培養(yǎng)、分組及加入相應(yīng)藥物；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液（1×104個(gè)/mL）；按照Hoechst 33258染色試劑盒說明書操作后，于熒光顯微鏡下觀察Hela細(xì)胞核形態(tài)并對(duì)圖像進(jìn)行分析。鏡下可見細(xì)胞呈藍(lán)色熒光；凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核濃染，或有變形、縮小或碎裂，或出現(xiàn)凋亡小體。

2.5 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot法檢測(cè)。按“2.3”項(xiàng)下方法取Hela細(xì)胞接種、培養(yǎng)，分為空白對(duì)照組（不含藥DMEM培養(yǎng)基）和大戟苷低、中、高劑量組（終質(zhì)量濃度分別為50、100、200 mg/L），加入相應(yīng)藥物；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰浴裂解25 min，收集細(xì)胞，在4 ℃條件下15 000 r/min離心25 min，取上清，采用BCA法進(jìn)行總蛋白定量，-80 ℃保存?zhèn)溆谩５鞍撞捎?0%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗（Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10、β-actin，稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜，然后加入二抗室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光法顯色。以β-actin為參比，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析目標(biāo)條帶的相對(duì)灰度值，以表示蛋白表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。應(yīng)用SPSS 15.0軟件對(duì)多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)組間兩兩比較進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大戟苷對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

與空白對(duì)照組比較，順鉑組和大戟苷低、中、高劑量組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物作用24、48、72 h后，細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明不同劑量的大戟苷對(duì)Hela細(xì)胞增殖均有顯著的抑制作用。各組細(xì)胞增殖抑制率比較見表1。

3.2 大戟苷對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

與空白對(duì)照組比較，順鉑組和大戟苷低、中、高劑量組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物作用48 h后，細(xì)胞凋亡率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明不同劑量的大戟苷均能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡。各組細(xì)胞的流式細(xì)胞圖見圖1，細(xì)胞凋亡率比較見表2。

3.3 大戟苷對(duì)Hela細(xì)胞核形態(tài)的影響

熒光顯微鏡下可見，與空白對(duì)照組比較，順鉑組細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的濃染、碎裂和凋亡小體；大戟苷低、中、高劑量組細(xì)胞的細(xì)胞核有不同程度的濃染或變形、縮小、碎裂，其中大戟苷中、高劑量組細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體。這表明大戟苷可劑量依賴性促進(jìn)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡。各組細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)顯微圖見圖2。

3.4 大戟苷對(duì)Hela細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，藥物作用48 h后，大戟苷低、中、高劑量組細(xì)胞中Cyt-C、Caspase-8和Caspase-9蛋白表達(dá)水平均顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平和Bcl-2/Bax比值均顯著降低；大戟苷中、高劑量組細(xì)胞中Bax、Caspase-3和Caspase-10蛋白表達(dá)水平均顯著升高，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白電泳圖見圖3，蛋白表達(dá)水平比較見表3。

4 討論

本課題組在預(yù)試驗(yàn)中考察了大戟苷對(duì)正常細(xì)胞系MRC-5細(xì)胞和人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的大戟苷（50、100、200 mg/L）均能顯著抑制Hela細(xì)胞增殖，但對(duì)MRC-5細(xì)胞未表現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用。因此，本研究采用上述劑量進(jìn)行試驗(yàn)。

線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡最主要的途徑之一，通常凋亡信號(hào)能引起線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔（PT）開放，導(dǎo)致線粒體跨膜電位下降和Cyt-C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[10]。作為凋亡誘導(dǎo)因子，Cyt-C能與凋亡酶激活因子（Apaf-1）、Caspase-9前體、腺嘌呤核糖核苷酸/腺嘌呤脫氧核糖核苷酸（ATP/dATP）形成凋亡體，然后募集并激活Caspase-3，進(jìn)而誘發(fā)Caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11-13]。同時(shí)，Bcl-2家族蛋白能夠調(diào)節(jié)PT孔的開放和關(guān)閉：促凋亡蛋白Bax可通過與PT孔的腺苷轉(zhuǎn)位因子（ANT）和電壓依賴性陰離子通道（VDAC）結(jié)合介導(dǎo)PT孔的開放，繼而發(fā)揮其促凋亡效應(yīng)；而抗凋亡蛋白Bcl-2則可通過與Bax競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合ANT或VDAC，繼而發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)[14-16]。本研究結(jié)果顯示，大戟苷能顯著誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，升高Cyt-C、Bax蛋白表達(dá)水平，降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平。這提示大戟苷能誘導(dǎo)Cyt-C向細(xì)胞質(zhì)釋放，從而啟動(dòng)線粒體凋亡途徑。

Caspase蛋白家族屬于半胱氨酸蛋白酶，是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，一旦被激活即能降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的死亡[17]。Caspase蛋白通常分為兩類：一類是啟動(dòng)者，如Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10，它們能通過自催化或自剪接的方式被激活，繼而引起Caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)；另一類是執(zhí)行者，如Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，它們可直接降解細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起細(xì)胞凋亡，但不能通過自催化或自剪接的方式被激活[18]。通常當(dāng)Cyt-C過度釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10接受凋亡信號(hào)后通過異源活化方式激活下游Caspase信號(hào)，將凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，被異源活化的Caspase-3等最終執(zhí)行細(xì)胞死亡程序[19-20]。本研究結(jié)果顯示，大戟苷能顯著升高Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10蛋白表達(dá)水平。這進(jìn)一步提示大戟苷能通過啟動(dòng)線粒體凋亡途徑而誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。

綜上所述，大戟苷能顯著抑制Hela細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用可能是通過激活Caspase依賴的線粒體凋亡途徑來實(shí)現(xiàn)的。

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（收稿日期：2018-04-25 修回日期：2018-08-24）

（編輯：段思怡）