蒙藥藍(lán)盆花乙醇提取物的血清藥物化學(xué)研究

馬飛祥 薛培鳳 韓盟帝 王媛媛

摘 要 目的：初步探討蒙藥藍(lán)盆花乙醇提取物在大鼠體內(nèi)的血中移行成分，為闡明該藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。方法：將10只大鼠隨機(jī)分成給藥組（以生藥量計為0.3 g/100 g）和空白組（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液），每組5只，灌胃給藥，給藥量均為2 mL/100 g，早、晚8：00各給藥1次，連續(xù)給藥3 d。末次給藥30 min后，肝門靜脈取血，經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀法分別制得含藥血清和空白血清樣品。以藍(lán)盆花原藥材為對照，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定，通過比較3種樣品的化學(xué)成分差異，再結(jié)合化合物對照品和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，鑒定藍(lán)盆花乙醇提取物灌胃后大鼠體內(nèi)的血中移行成分。結(jié)果：共發(fā)現(xiàn)了39個血中移行成分，其中原型成分17個、代謝成分22個，原型成分主要為黃酮類及苯丙酸類，在大鼠體內(nèi)多發(fā)生甲基化、硫酸化與葡萄糖醛酸化等反應(yīng)。結(jié)論：初步確定了大鼠灌胃藍(lán)盆花乙醇提取物后的入血成分，為該藥材進(jìn)一步的體內(nèi)代謝研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 藍(lán)盆花；血清藥物化學(xué)；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；血中移行成分；大鼠

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）21-2953-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.17

ABSTRACT OBJECTIVE： To preliminarily investigate the constituents absorbed into the blood of ethanol extract from Mongolia medicine Scabiosa comosa in rats， and to provide reference for clarifying the effective substance basis of the medicine. METHODS： Ten rats were randomly divided into administration group （0.3 g/100 g by crude drug） and blank group （0.5% CMC-Na solution）， with 5 rats in each group. The were given relevant medicine intragastrically 2 mL/100 g， at 8：00 morning and evening， for consecutive 3 d. 30 min after last administration， blood samples were collected from hepatic portal vein. The containing serum samples and blank serum samples were prepared by organic solvent precipitation. UPLC-MS/MS method was adopted by using S. comosa as control. Through comparing chemical components of 3 kinds of samples， constituents of ethanol extract from S. comosa in rats after intragastric administration were identified on the basis of compound control and literature data. RESULTS： Totally 39 constituents absorbed into blood were found， of which 17 were prototype components and 22 related metabolites. The prototype components were mainly flavonoids and phenylpropionic acid. Methylation， sulfation and glucose aldehyde reactions were observed in rats. CONCLUSIONS： The constituents into the blood of ethanol extract from S. comosa in rats are confirmed preliminarily after intragastric administration， which lay a foundation for further metabolism study in vivo.

KEYWORDS Scabiosa comosa； Serum pharmacochemistry； UPLC-MS/MS； Constituents absorbed into the blood； Rats

藍(lán)盆花的蒙藥名為“陶森-陶日莫”，又稱蒙古山蘿卜，是來源于川續(xù)斷科（Dipsacaceae）植物窄葉藍(lán)盆花（Scabiosa comosa Fisch. ex Roem.et Schult）和華北藍(lán)盆花（Scabiosa tschiliensis Grunning）的干燥花序，為蒙藥專用品種之一[1]。該藥具有清熱、清“協(xié)日”之功效，蒙醫(yī)臨床用于治療肝火頭痛、發(fā)燒、肺熱咳嗽、黃疸等病，可單用也可配方使用[2]。目前，從藍(lán)盆花的花序中分離鑒定了37個化學(xué)成分[3-7]，其中本課題組共分離得到22個化合物[8]，并建立了該藥材的特征圖譜及7個成分的含量測定方法[9]，總結(jié)發(fā)現(xiàn)主要含有黃酮類（木犀草素與芹菜素及其氧苷類）、苯丙酸類（綠原酸及異綠原酸類）與環(huán)烯醚萜類（馬錢素、獐牙菜苷等）化合物，這3類成分是蒙藥藍(lán)盆花及其同屬植物中含有的主要化學(xué)成分類型，且具有較強(qiáng)的藥理活性[10-11]。但該藥化學(xué)成分在體內(nèi)的變化尚不明確，導(dǎo)致該藥的有效成分模糊不清，質(zhì)量控制難以把握。鑒于此，本課題組利用血清藥物化學(xué)方法[12]，對藍(lán)盆花提取物灌胃后大鼠血中移行成分進(jìn)行初步研究，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的進(jìn)一步研究開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Dionex UltiMate 3000快速超高效液相色譜儀（包括雙三元梯度泵、自動進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、進(jìn)樣恒溫箱）、Q-Exactive組合型四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（包括電噴霧離子源、Analyst QS2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）均購自美國Thermo Fisher公司；TDZ5-WS臺式低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；MX-S旋渦混合器（美國Scilogex公司）；HX-2D 氮氣吹干儀（恒信科技有限公司）；3-18K高速溫控離心機(jī)（德國Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

藍(lán)盆花藥材購自安國路通中藥飲片有限公司（批號：150301），由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院喬俊纏教授鑒定為華北藍(lán)盆花（Scabiosa tschilliensis Grunning）的干燥花序；奎寧酸 （批號：SH17071211）、綠原酸 （批號：SH17050201）、秦皮乙素（批號：SH17053218）、咖啡酸 （批號：SH17051207）、木犀草苷 （批號：SH16070401）、野漆樹苷 （批號：SH0977）、異綠原酸B （批號：wkq16040902）、異綠原酸A （批號：SH17092212）、大波斯菊苷（批號：SH17102501）、異綠原酸C（批號：SH17120111）、木犀草素（批號：SH16041006）、芹菜素（批號：SH17032405）、香葉木素（批號：wkq16080501）對照品均購自北京賽百草科技有限公司，純度：均≥98%；異葒草素對照品（本實驗室自制，批號：20160018，純度：≥98%）；乙腈、甲醇為色譜純，甲酸、乙醚等試劑為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 動物

SPF級健康Wistar大鼠10只，♂，體質(zhì)量（200±20）g，購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物研究中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蒙）2016-001。

2 方法與結(jié)果

2.1 藍(lán)盆花藥液的制備

取蒙藥藍(lán)盆花藥材500 g，以12倍量70%乙醇加熱回流提取3次，每次2.5 h，合并3次濾液，減壓濃縮至無醇味，進(jìn)行冷凍干燥，得藍(lán)盆花凍干粉。用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液溶解凍干粉，制成0.05 g/mL（相當(dāng)于藍(lán)盆花生藥量0.15 g）的灌胃藥液，放入4 ℃冰箱中保存，使用前超聲（功率250 W，頻率40 kHz）30 min混合均勻，即得。

2.2 空白血清和含藥血清的制備及處理

2.2.1 血清樣品的制備 取Wistar大鼠10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成空白組和給藥組，每組5只。給藥前12 h禁食、自由飲水，給藥組大鼠灌胃“2.1”項下藥液，空白組大鼠灌胃0.5% CMC-Na溶液，給藥量均為2 mL/100 g（相當(dāng)于人臨床等效劑量的10倍），連續(xù)給藥3 d，早、晚8：00各給藥1次。末次給藥30 min后，乙醚麻醉，肝門靜脈取血，靜置1 h，然后在室溫條件下以3 500 r/min離心15 min，收集血清，將同組大鼠血清混合，即得到空白血清和含藥血清樣品。

2.2.2 血清樣品的處理 取1 mL血清樣品，置于具塞離心管中，加入3倍量乙腈，搖勻，在20 ℃下以14 360×g離心15 min；取上清液，在37 ℃下氮氣吹干，再用100 μL的60%甲醇復(fù)溶，再次在20 ℃下以14 360×g離心10 min，取上清液，即得到空白血清和含藥血清的分析樣品。

2.3 分析條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：COSMOSIL C18（250 mm×4.6 mm，4.6 ?m）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～15 min，5%→15%A；15～20 min，15%→18%A；20～25 min，18%→20%A；25～50 min，20%→28%A；50～60 min，28%→30%A；60～70 min，30%→80%A；70～80 min，80%A）；柱溫：20 ℃；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 ?L。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源，溫度：400 ℃；鞘氣：45 arb，輔助氣：2 arb；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子傳輸管溫度：150 ℃；掃描模式：全離子監(jiān)測模式，采集范圍：100～1 250 Da，負(fù)離子采集；一級質(zhì)譜分辨率：70 000，二級質(zhì)譜分辨率：17 500。

2.4 蒙藥藍(lán)盆花血中移行成分鑒定

2.4.1 原型成分鑒定 取“2.2”項下含藥血清樣品和空白血清樣品；取“2.1”項下凍干粉，60%甲醇溶解，0.45 μm微孔濾膜濾過，取連續(xù)濾液，即得原藥材樣品。同時將已有的對照品分別溶解（60%甲醇），得混合對照品溶液Ⅰ（含奎寧酸、綠原酸、咖啡酸、異葒草素、野漆樹苷、異綠原酸B、大波斯菊苷和木犀草素）、混合對照品Ⅱ（含秦皮乙素、木犀草苷、芹菜素、香葉木素）和混合對照品Ⅲ（含異綠原酸A和異綠原酸C）。將上述溶液均按“2.3”項下分析條件分別進(jìn)樣，記錄圖譜。根據(jù)藍(lán)盆花藥材樣品、含藥血清樣品及對照品圖譜情況，使用精確相對分子質(zhì)量與分子碎片峰尋找，并結(jié)合相對色譜保留時間與質(zhì)譜二級碎片信息進(jìn)行指認(rèn)，無對照品的原型成分通過與文獻(xiàn)報道的質(zhì)譜二級碎片信息進(jìn)行比對指認(rèn)。結(jié)果，最終共鑒定出17個原型成分，分別為奎寧酸（1）、綠原酸（2）、秦皮乙素（3）、咖啡酸（4）、異葒草素（5）、木犀草苷（6）、野漆樹苷（7）、異綠原酸B（8）、異綠原酸A（9）、大波斯菊苷（10）、木犀草-4′ -糖苷（11）、異綠原酸C（12）、對羥基苯甲酸（13）、木犀草素（14）、芹菜素（15）、香葉木素（16）、熊果酸（17），其中編號為11、13、17的原型成分是根據(jù)文獻(xiàn)[7，13-14]推斷鑒定的，其余均是由對照品對照鑒定。通過分析發(fā)現(xiàn)，藍(lán)盆花含藥血清中主要含有以芹菜素、木犀草素及其氧苷為主的黃酮類化合物，以及咖啡酸、綠原酸及其相似結(jié)構(gòu)化合物為代表的苯丙酸類化合物?？傠x子流圖見圖1，化合物信息見表1。

2.4.2 代謝途徑及代謝產(chǎn)物推斷 對于圖中其余未知峰，筆者通過查閱相關(guān)的代謝產(chǎn)物、代謝途徑與質(zhì)譜裂解規(guī)律，共推斷出了22個代謝產(chǎn)物（M1～M22），詳見表2。

具體推斷過程如下：

（1）黃酮類化學(xué)成分。黃酮類化合物經(jīng)灌胃給藥后，多在肝及腸、胃代謝，再經(jīng)腸、胃吸收，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，其苷類多被水解，以苷元的形式發(fā)生轉(zhuǎn)化。有學(xué)者[15-16]將木犀草素與木犀草苷灌胃大鼠，收集各時間點內(nèi)的血漿、尿液、糞便，總結(jié)出木犀草素在大鼠體內(nèi)多發(fā)生氧化、甲基化、葡萄糖醛酸化反應(yīng)等，而木犀草苷在腸道中被水解為苷元后，發(fā)生以上反應(yīng)。芹菜素在體內(nèi)多產(chǎn)生2、3位雙鍵還原反應(yīng)，以硫酸酯、葡萄糖醛酸的形式排出體外，其裂解規(guī)律為A環(huán)掉一個或多個—CO2等[17]。通過以上總結(jié)與二級質(zhì)譜信息對比，推測木犀草素和芹菜素主要是以甲基化反應(yīng)、硫酸化反應(yīng)、葡萄糖醛酸化反應(yīng)及復(fù)合反應(yīng)進(jìn)行代謝，其代謝途徑見圖2。

（2）苯丙酸類成分。苯丙酸類成分中咖啡酸的代謝產(chǎn)物多為甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化及其結(jié)合型產(chǎn)物[19]；綠原酸的代謝途徑以水解、甲基化、還原及結(jié)合反應(yīng)為主，且在體內(nèi)多代謝成咖啡酸、奎寧酸、阿魏酸及異阿魏酸等[19-20]；異綠原酸類的代謝多分成三步，即首先水解生成單咖啡?？鼘幩犷?，后續(xù)代謝途徑與綠原酸和咖啡酸途徑相同[21-23]。通過以上總結(jié)與二級質(zhì)譜信息對比，推測主要的苯丙酸類化合物綠原酸和咖啡酸的代謝途徑如圖3所示，主要是以水解與還原反應(yīng)、甲基化反應(yīng)、硫酸化反應(yīng)及復(fù)合反應(yīng)方式進(jìn)行代謝。

3 討論

在本研究中，共發(fā)現(xiàn)灌胃給藥藍(lán)盆花39個血中移行成分，其中黃酮類與苯丙酸類化學(xué)成分體內(nèi)吸收入血較多，且黃酮苷類化學(xué)成分多代謝成苷元形式吸收入血，代謝較快；苯丙酸類化學(xué)成分在體內(nèi)多代謝成咖啡酸及其代謝產(chǎn)物后吸收入血，綠原酸在體內(nèi)可發(fā)生酯基位置異構(gòu)，其代謝產(chǎn)物多出現(xiàn)同分異構(gòu)現(xiàn)象，通過二級質(zhì)譜信息只能推斷，不能詳細(xì)鑒定。從各一級質(zhì)譜圖對比觀察，含藥血清藥品中木犀草素、芹菜素含量明顯高于其他成分，其次為香木葉素、秦皮乙素、咖啡酸、對羥基苯甲酸，均為藍(lán)盆花在大鼠體內(nèi)的主要血中移行成分。萜類化合物及環(huán)烯醚萜類化合物在血中移行成分中尚未發(fā)現(xiàn)，推測該類化合物可能因為含量低或代謝物少檢測不到，故有待深入研究。本次研究對藍(lán)盆花大鼠體內(nèi)血中移行成分進(jìn)行了初步探討，可為該藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)篩選提供依據(jù)，為該藥的深層次開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-01-23 修回日期：2018-09-11）

（編輯：林 靜）