HPLC法同時測定萊菔子中蘿卜硫苷和4—甲基亞磺?；?—丁烯基硫代葡萄糖苷的含量

高榮凱 關(guān)亮俊 任海東 王敏 李琦 張宏桂

摘 要 目的：建立同時測定萊菔子中蘿卜硫苷和4-甲基亞磺酰基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Welch Ultimate LP-C18，流動相為甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為235 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 ?L。采用建立的方法測定5個產(chǎn)地共15批樣品中蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷的含量。結(jié)果：蘿卜硫苷、4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷進樣量分別在0.248～3.960、0.903～14.442 ?g（r≥ 0.999 6）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；檢測限分別為0.009 9、0.003 5 ?g，定量限分別為0.024 8、0.008 9 ?g；精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗的RSD均<2%（n=6）；平均回收率分別為99.83%、100.40%（RSD分別為1.42%、1.50%，n=6）。在安徽、甘肅、河北、山東、云南5個產(chǎn)地共15批的萊菔子中，蘿卜硫苷的平均含量分別為1.881、5.120、3.634、3.237、2.856 mg/g（n=3）；4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷的平均含量分別為37.561、46.389、40.136、37.000、41.101 mg/g（n=3）。結(jié)論：所建立的含量測定方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，可用于萊菔子中蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷含量的同時測定；5個產(chǎn)地萊菔子樣品中蘿卜硫苷和4-甲基亞磺酰基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷的平均含量均以甘肅產(chǎn)最高。

關(guān)鍵詞 萊菔子；高效液相色譜法；蘿卜硫苷；4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷；含量測定；產(chǎn)地

中圖分類號 R917；R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）21-2898-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.05

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of glucoraphanin and 4-methylsulfoyl-3-butenyl glucosinolate in the seeds of Raphanus sativus. METHODS： HPLC was adopted. The determination was performed on Welch Ultimate LP-C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.05 mol/L monobasic potassium phosphate （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 235 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 20 ?L. The established method was used to determine the contents of glucoraphanin and 4-methylsulfoyl-3-butenyl glucosinolate in 15 batches of samples from 5 producing areas. RESULTS： The linear range of glucoraphanin and 4-methylsulfoyl-3-butenyl glucosinolate were 0.248-3.960 and 0.903-14.442 ?g （r≥0.999 6）， respectively. The detection limits were 0.009 9 and 0.003 5 ?g， and limits of quantitation were 0.024 8 and 0.008 9 ?g， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 2% （n=6）. The average recoveries were 99.83% and 100.40% （RSD=1.42%， 1.50%，n=6）. The average contents of 15 batches of glucoraphenin in the seeds of R. sativus from producing areas （Anhui， Gansu， Hebei， Shandong， Yunnan） were 1.881， 5.120， 3.634， 3.237 and 2.856 mg/g （n=3）. Average contents of 4-methylsulfoyl-3-butenyl glucosinolate were 37.561， 46.389， 40.136， 37.000， 41.101 mg/g （n=3）. CONCLUSIONS： The established method is simple， accurate and repeatable， which can be used for content determination of glucoraphanin and 4-methylsulfoyl-3-butenyl glucosinolate in the seeds of R. sativus. Among samples of 5 producing areas， average contents of glucoraphanin and 4-methylsulfoyl-3-butenyl glucosinolate in the seed of R. sativus from Gansu province are the highest.

KEYWORDS Seeds of Raphanus sativus； HPLC； Glucoraphanin； 4-methylsulfoyl-3-butenyl glucosinolate； Content determination； Producing areas

萊菔子為十字花科植物蘿卜（Raphanus sativus L.）的干燥成熟種子，具有消食除脹、降氣化痰的功效，多用于飲食停滯、脘腹脹痛、大便秘結(jié)、積滯瀉痢、痰壅喘咳等癥[1]。萊菔子中異硫氰酸鹽類成分萊菔硫烷是蘿卜硫苷（4-甲基亞磺酰基丁基硫代葡萄糖苷）的主要酶解產(chǎn)物，具有很好的抗癌活性，且抗癌機制也較為清晰[2-4]。由于萊菔硫烷的穩(wěn)定性差，其較為穩(wěn)定的前體成分蘿卜硫苷是一種非常好的抗癌前體藥物，已經(jīng)被開發(fā)為多種防癌或抗癌產(chǎn)品，比如主要有效成分為蘿卜硫苷的西蘭花種子水提物作為2017年國家衛(wèi)生和計劃生育委員會公布的新食品原料已被廣泛應(yīng)用[5]。蘿卜硫苷主要存在于西蘭花籽中，在萊菔子中含量并不高[6]，但萊菔子中的主要硫苷類成分4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷與蘿卜硫苷結(jié)構(gòu)十分相似，兩者只在側(cè)鏈R的結(jié)構(gòu)上有一個雙鍵的區(qū)別，4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷降解產(chǎn)物萊菔素也具有與萊菔硫烷類似的活性[7-8]，但有研究表明萊菔素粗提物對部分癌細胞的抑制效果不明顯[9]，且抗癌機制研究較少，并不明確[10-11]，所以蘿卜硫苷更具有應(yīng)用和開發(fā)前景。由于西蘭花籽來源較少、價格昂貴，而萊菔子來源更加廣泛、價格更加低廉，且4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷氫化加氫轉(zhuǎn)化為蘿卜硫苷的研究有了很大進展，主要包括化學(xué)轉(zhuǎn)化法[11-12]及生物轉(zhuǎn)化法[13]兩個方面，這使得兩者之間的轉(zhuǎn)化更具有可行性，所以建立一種能同時快速檢測萊菔子中蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷含量的方法更具有實際意義。由于硫苷類成分為含硫的陰離子親水性化合物，特別是蘿卜硫苷和4-甲基亞磺酰基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷這類大極性硫苷，在普通的反相色譜柱上的保留時間較短，得不到好的分離效果。本研究旨在建立一種能同時對萊菔子中蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷兩種大極性葡萄糖硫苷類成分分析定量，且簡便、快速的高效液相色譜（HPLC）法。隨后用此方法對萊菔子幾個主要產(chǎn)地，包括甘肅、河北、云南、安徽、山東的共15批藥材中2種葡萄糖硫苷類成分的含量進行測定，并對測定結(jié)果進行初步分析。蘿卜硫苷和4-甲基亞磺酰基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)式見圖1。

1 材料

1.1 儀器

1525-2489 HPLC儀，包括Breeze2 色譜工作站、2489紫外-可見檢測器（美國Waters公司）；LD5-2B低速離心機（北京京立離心機有限公司）；FA1004B分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甘肅、河北、云南、安徽、山東5個產(chǎn)地共15批萊菔子藥材樣品（序號分別為S1～S15）均購自安國藥材市場及亳州藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張宏桂教授鑒定為十字花科植物蘿卜Raphanus sativus L.的干燥成熟種子；蘿卜硫苷對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：L-030-180413，純度：≥98.5%）；4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷對照品（上海子起生物科技有限公司，批號：29510701，純度：≥98.5%）；甲醇為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate LP-C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：甲醇（A）-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（B），梯度洗脫（1～10 min，100%→95%B；10～25 min，95%→80%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：235 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 ?L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加純水制成質(zhì)量濃度分別為0.247 5、0.902 6 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取萊菔子樣品（100 ℃烘箱中烘2 h）粉末（過40目篩）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入沸水30 mL，沸水水浴加熱30 min，離心 （4 000 r/min）10 min，取上清液，如此反復(fù)3次，純水定容在100 mL量瓶中，搖勻，取適量溶液用0.45 ?m的微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 空白溶液 取流動相適量作為空白溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取 “2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，各待測成分間、待測成分與雜質(zhì)峰間均能達到基線分離，分離度大于1.5，理論板數(shù)以4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷計不低于5 000，色譜圖見圖2。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL，用純水定容在10 mL量瓶中，即得6個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。取適量溶液，用0.45 ?m的微孔濾膜過濾后，分別精密吸取20 ?L注入HPLC儀，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。結(jié)果，蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷的回歸方程分別為y=366 211x+608.16（r=0.999 7）、y=789 864x+63 620（r=0.999 6），表明進樣量分別在0.248～3.960、0.903～14.442 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并分別把不同質(zhì)量濃度的稀釋液按“2.1”項下色譜條件進樣測定。當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限；當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限。結(jié)果，蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷的檢測限分別為0.009 9、0.003 5 ?g，定量限分別為0.024 8、0.008 9 ?g。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.67%、0.65%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取樣品序號為S6的萊菔子藥材1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，蘿卜硫苷和4-甲基亞磺酰基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.96%、0.97%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取樣品序號為S6的萊菔子藥材6份，每份約1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷含量的平均值分別為3.660、44.449 mg/g，RSD分別為1.77%、1.65%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收試驗

精密稱取樣品序號為S6的萊菔子藥材約0.5 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入一定量的蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結(jié)果見表1。

2.10 樣品含量測定

分別精密稱取5個產(chǎn)地共15批藥材樣品粉末3份，每份約1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 供試品溶液的制備條件考察

3.1.1 提取方式的選擇 筆者在供試品溶液制備時，提取方式選擇了直接加入沸水，并在沸水中水浴加熱提取的方法，主要原因為多數(shù)文獻在制備硫苷用于分析定量時均采用沸水提取[14-15]，也有文獻證明沸水是更好的硫苷提取溶劑[16]。有研究表明，在45 ℃或室溫條件下黑芥子酶酶解4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷的速率最高，但過高的溫度會使酶的活性降低[9]。所以，直接加入沸水既減少了葡萄糖硫苷類成分在水升溫過程中被黑芥子酶酶解的損失，還能節(jié)約提取時間。

3.1.2 料液比的選擇 筆者在試驗中考察了20、30、40、50、60共5個提取溶劑倍量，含量測定結(jié)果表明，蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷的含量在溶劑倍量為30之前隨提取溶劑倍量增加而增加，當溶劑倍量≥30時，2個目標成分的含量均無顯著增加，故提取溶劑倍量選擇30。

3.1.3 提取時間的選擇 筆者在試驗中考察了15、30、45、60 min共4個提取時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在提取時間≥30 min時，2個目標成分的含量無顯著增加，故提取時間選擇30 min。

3.1.4 提取次數(shù)的選擇 筆者在試驗中考察了2、3、4次共3個提取次數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取次數(shù)為3次及以上時，2個目標成分的含量無顯著增加，故提取次數(shù)選擇3次。

3.2 檢測波長和色譜柱的選擇

在關(guān)于蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷分析的多數(shù)文獻中，檢測波長均選擇了235 nm[14-15，17]，本文也以235 nm作為檢測波長。本文分析的2種葡萄糖硫苷屬于極性大的硫苷，普通的反相色譜柱不能實現(xiàn)兩者的分離，本文選擇的Welch Ultimate LP-C18色譜柱可以用純水沖洗，增大了分離樣品的極性范圍，在調(diào)整好流動相后，蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷兩者的分離度大于1.5，分離效果良好。

3.3 不同產(chǎn)地樣品中蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷含量測定結(jié)果分析

本文建立了同時測定萊菔子中蘿卜硫苷和4-甲基亞磺酰基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷含量的HPLC法，并對5個產(chǎn)地共15批樣品中兩者的含量進行了測定。結(jié)果顯示，在安徽、甘肅、河北、山東、云南5個產(chǎn)地中，蘿卜硫苷和4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷的含量均以甘肅產(chǎn)萊菔子最高。

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（收稿日期：2018-06-19 修回日期：2018-08-06）

（編輯：余慶華）