連翹復(fù)配黃芩茵陳涂膜劑的制備及在鮮豬肉保鮮中的應(yīng)用效果

何 皎，牛明福，張改平

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471000；2.食品微生物河南省工程研究中心，河南洛陽(yáng) 471000；3.河南科技大學(xué)微生物資源開發(fā)與利用校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng) 471000；4.食品原料河南省工程技術(shù)研究中心，河南洛陽(yáng) 471000）

鮮豬肉有風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的特點(diǎn)，是中國(guó)餐桌最為常見的食用肉類，但其保質(zhì)短、易變質(zhì)。鮮豬肉的變質(zhì)主要是微生物的滋生和脂肪的氧化，食用變質(zhì)豬肉會(huì)引起腹瀉、嘔吐等癥狀，甚至?xí)鹁Y，因此開發(fā)保鮮效果好的防腐劑用于豬肉保鮮具有非常重要的意義。在食品工業(yè)中，傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑因其潛在危害越來越不被人們接受[1-2]，新型天然防腐劑越來越受到消費(fèi)者的歡迎。研究表明，許多常用中藥具有很好的抑菌和抗氧化活性，可作為高效低毒的食品防腐劑用于食品防腐保鮮[3-4]。

茵陳具有抑菌性能，能夠抑制霉菌和致病菌的生長(zhǎng)[5-7]；連翹對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等均具有較好的抑菌作用；黃芩在抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)及治療心血管疾病等很多方面都表現(xiàn)極好[8-9]，這三者是傳統(tǒng)處方藥甘露消毒丸的主要成分。因此，以它們的提取物作為新型保鮮防腐劑具有天然性、食用安全性高等優(yōu)勢(shì)。采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)的方法，以甘露消毒丸的配伍比例為基礎(chǔ)，將連翹、茵陳和黃芩進(jìn)行復(fù)配醇提，并進(jìn)行醇提物活性研究，確定了復(fù)配方劑發(fā)揮活性的最佳比例、最佳醇提條件，比較了復(fù)配前后的抑菌和抗氧化活性，同時(shí)驗(yàn)證了提取液與涂膜劑在鮮豬肉中的保鮮效果，為開發(fā)新型中藥類鮮豬肉防腐劑提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

連翹、茵陳、黃芩、維C 等，購(gòu)自洛陽(yáng)市張仲景大藥房；鮮豬肉，購(gòu)自洛陽(yáng)市大張超市；胰蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、葡萄糖等，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；無水乙醇、氯化鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁等，均為分析純；尼泊金甲酯，味多美實(shí)業(yè)有限公司提供；C3500 型厭氧產(chǎn)氣袋，三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社提供；T-AOC 型檢測(cè)試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.1.2 菌種

沙門氏菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、意大利青霉、指狀青霉等菌種，河南科技大學(xué)微生物資源開發(fā)與利用校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試品的制備

連翹、茵陳、黃芩分別于60 ℃下烘干后粉碎，過120 目篩，置于棕色瓶中備用。

1.2.2 提取工藝單因素試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，影響連翹、黃芩和茵陳醇提物（抑菌、抗氧化） 的主要因素為料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間，分別選取6 個(gè)料液比水平（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30）、6 個(gè)溫度水平（45，55，65，75，85，95 ℃）、6 個(gè)乙醇體積分?jǐn)?shù)（25%，35%，45%，55%，65%，75%） 和6 個(gè)時(shí)間水平（1，2，3，4，5，6 h），通過單因素試驗(yàn)得到醇提物抑菌和抗氧化活性較好的相關(guān)工藝參數(shù)。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化連翹、黃芩和茵陳提取工藝試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將連翹、黃芩和茵陳提取工藝對(duì)沙門氏菌抑菌活性能力影響較顯著的4 個(gè)因素料液比（X1）、提取溫度（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）、提取時(shí)間（X4） 進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)Boxbehnken 的組合設(shè)計(jì)原理，用Design Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)四因素三水平，中心點(diǎn)重復(fù)3 次試驗(yàn)，進(jìn)行Box-behnken 響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.2.4 連翹、黃芩和茵陳醇提物的提取工藝流程

精確稱取連翹2 g，黃芩4 g，茵陳4 g，置于具塞錐形瓶中（單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)考查確定連翹、黃芩和茵陳復(fù)配效果最佳比例為1∶2∶2）。提取液按比例，于功率80 W，40 kHz 下超聲提取35 min后，以不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行提取試驗(yàn)。然后于4 ℃條件下，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心10 min，取上清液，過濾減壓濃縮濾液至1 g/mL，獲得復(fù)配醇提物樣品。

1.2.5 連翹、黃芩和茵陳復(fù)合涂膜劑的制備

準(zhǔn)確稱量?jī)?yōu)化脫色后的復(fù)配連翹、黃芩和茵陳醇提物的凍干粉1.25 g 于燒杯中，加入97 mL 蒸餾水，置于磁力攪拌器加熱攪拌均勻；緩慢加入2 mL甘油，1 mL 吐溫80，攪拌5 min；加入1 g 可溶性淀粉到成膜劑中，于90 ℃水浴中攪拌30 min 后，放入冰箱4 ℃冷藏備用。

1.2.6 抑菌與抗氧化雙活性檢測(cè)

（1） 培養(yǎng)基制備與菌種活化。BPA 培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基配方均參考盧圣棟《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二版。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、酵母菌、痤瘡丙酸桿菌、曲霉、意大利青霉菌、指狀青霉等分別采用相應(yīng)培養(yǎng)基復(fù)蘇備用。

（2） 復(fù)配提取物抑菌活性的測(cè)定。將活化好的細(xì)菌及酵母菌菌株分別取1 mL 接種至裝有200 mL的相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)。在帶孔混菌平板中按順序加入200 μL 復(fù)配醇提物、200 μL 相應(yīng)乙醇體積分?jǐn)?shù)作為陰性對(duì)照，200 μL 相應(yīng)濃度的尼泊金甲脂醇溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，每組設(shè)3 個(gè)平行，平板于相應(yīng)溫度恒溫培養(yǎng)12~24 h，電子游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，記錄數(shù)據(jù)。霉菌抑菌率測(cè)定方法為在盧聲潔等人[10]基礎(chǔ)上改進(jìn)后取1 mL 待測(cè)液，稀釋至20 mg/mL。按0.05%~7.00%添加量混勻于20 mL 的PDA 固體培養(yǎng)基內(nèi)，取霉菌菌絲點(diǎn)于培養(yǎng)基中央，于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)18 h，測(cè)量菌落直徑。

（3） 復(fù)配醇提物的抗氧化測(cè)定。DPPH·清除能力測(cè)定方法在Zhang Y F 等人、葛水蓮等人[12-13]基礎(chǔ)上改進(jìn)后為：將提取液進(jìn)行50 倍稀釋后保存于帶塞試管作為待測(cè)液；吸取2.0 mL 待測(cè)液，加入0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液4.0 mL，搖勻26 ℃恒溫避光反應(yīng)30 min，以無水乙醇調(diào)零；于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度A1，用無水乙醇代替DPPH·所測(cè)值為吸光度A2，用無水乙醇代替待測(cè)液所測(cè)值為吸光度A0，同時(shí)以質(zhì)量濃度1 mg/mL 維C 溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品做3 次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Q 值檢測(cè)?；钚杂?jì)算公式：

1.2.7 鮮豬肉的分割處理及復(fù)合涂膜劑保鮮材料的添加

刀具及案板用75%酒精消毒后，置于超凈工作臺(tái)紫外殺菌30 min，在超凈臺(tái)中取出肉進(jìn)行切割處理，將肉切成50 g 左右的塊狀，備用。

1.2.8 鮮豬肉的保鮮試驗(yàn)

（1） 用生理鹽水將復(fù)合凍干粉溶液涂膜劑及凍干粉配制成溶液稀釋，質(zhì)量濃度分別為250，50，1 μg/mL。

（2） 復(fù)合涂膜法處理鮮豬肉。將切塊后的豬肉在不同質(zhì)量濃度的涂膜劑中浸泡15 s，瀝水3~5 min。

（3） 噴涂法處理鮮豬肉。將不同質(zhì)量濃度的凍干粉溶液在豬肉表面進(jìn)行噴涂處理，用無菌噴霧瓶在豬肉表面噴灑。

（4） 設(shè)置空白對(duì)照組（生理鹽水進(jìn)行處理）。

（5） 將豬肉放置于無菌托盤后用食品級(jí)保鮮膜密封，置于4 ℃條件下避光保存。

（6） 分別在第0 天，第1 天，第2 天，第3 天，第4 天，第5 天，第6 天取樣進(jìn)行pH 值、總揮發(fā)性鹽基氮TVB-N 和活菌計(jì)數(shù)TVC 測(cè)定及感官評(píng)價(jià)。pH 值檢測(cè)，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.237—2016 法對(duì)豬肉樣品進(jìn)行pH 值檢測(cè)?？倱]發(fā)性堿性氮TVB-N檢測(cè)，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.228—2016 法對(duì)豬肉樣品進(jìn)行TVB-N 檢測(cè)。活菌計(jì)數(shù)TVC 檢測(cè)，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4798.2—2016 法對(duì)豬肉樣品進(jìn)行TVC檢測(cè)。感官評(píng)價(jià)，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4798.2—2016法對(duì)豬肉樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)操作，所有數(shù)據(jù)用X±s 表示。采用Origin 8.0、Design Expert 8.0.6 等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析響應(yīng)面試驗(yàn)分析因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)分析因素與水平設(shè)計(jì)

使用Design Expert 8.0.6.1 版本中的Box-behnken程序設(shè)計(jì)四因素三水平的RSM 試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并將各變量的水平轉(zhuǎn)化成編碼制。使用了Design Expert 8.0.6.1 軟件中的ANOVA 功能對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，建立響應(yīng)面回歸模型，得到回歸方程：

通過軟件中的Optimization 程序優(yōu)化預(yù)測(cè)得到最適料液比1∶15.57，提取溫度65.45 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)65.26%，提取時(shí)間2.24 h，在這個(gè)最優(yōu)條件下得到抑菌圈為23.731 6 mm。為方便試驗(yàn)，選用料液比1∶15，提取溫度65 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，提取時(shí)間2.5 h 進(jìn)行驗(yàn)證。通過3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到抑菌圈大小為24.05 mm，與預(yù)測(cè)值非常接近，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的條件準(zhǔn)確、可信，按照模型進(jìn)行試驗(yàn)準(zhǔn)確可行。

料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取時(shí)間交互作用對(duì)抑菌率的響應(yīng)面及等高線見圖1。

圖1 料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取時(shí)間交互作用對(duì)抑菌率的響應(yīng)面及等高線

由圖1 可知，響應(yīng)曲面坡度越峭，表明響應(yīng)值對(duì)于試驗(yàn)中條件的變化敏感，中心在考查區(qū)域內(nèi)，說明考查區(qū)域范圍內(nèi)存在最大響應(yīng)值。

此外響應(yīng)面因素對(duì)抑菌效果與對(duì)總抗氧化能力影響為提取時(shí)間（D） >提取溫度（B） > 料液比（A） >乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）。

2.1.2 復(fù)配醇提物與單獨(dú)的連翹、黃芩和茵陳提取物的抑菌活性的比較

連翹、黃芩和茵陳與連翹、黃芩和茵陳醇提物的抑菌活性的比較見表2。

表2 連翹、黃芩和茵陳與連翹、黃芩和茵陳醇提物的抑菌活性的比較

由表2 可知，復(fù)配后醇提物的抑菌活性比單獨(dú)藥物提取物的抑菌活性有所提高，試驗(yàn)組對(duì)酵母菌、霉菌的抑菌效果均優(yōu)于沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌，說明連翹、黃芩和茵陳醇提物對(duì)真菌的抑菌效果可能優(yōu)于細(xì)菌，而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果接近革蘭氏陰性菌。

2.1.3 復(fù)配醇提物與單獨(dú)的連翹、黃芩和茵陳提取物的抗氧化能力對(duì)比

連翹、黃芩和茵陳的抗氧化性能見表3。

表3 連翹、黃芩和茵陳的抗氧化性能

由表3 可知，連翹、黃芩和茵陳復(fù)配后的抗氧化性能有較大提升，復(fù)配液和維C 溶液對(duì)DPPH 自由基清除率分別為96.10%和97.55%，清除能力接近。

2.2 豬肉保鮮試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 活菌計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的凍干復(fù)溶制劑對(duì)鮮豬肉TVC 含量的影見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度的凍干復(fù)溶制劑對(duì)鮮豬肉TVC 含量的影響

新鮮肉的活菌數(shù)應(yīng)小于104CFU/g，次鮮肉為104~106CFU/g，變質(zhì)肉大于106CFU/g[15]。由圖2 可知，噴涂法和涂膜劑法處理的豬肉的保鮮期均延長(zhǎng)了2 d。說明在活菌數(shù)層面上涂膜劑法和噴涂法的保鮮效果基本相同。

2.2.2 總揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N） 檢測(cè)結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的凍干復(fù)溶制劑對(duì)鮮豬肉TVB-N的影響見圖3。

圖3 不同質(zhì)量濃度的凍干復(fù)溶制劑對(duì)鮮豬肉TVB-N 的影響

新鮮肉的TVB-N 應(yīng)小于1.5 mg/g，次鮮肉小于0.2 mg/g，變質(zhì)肉大于0.2 mg/g[15]，由圖3 可知，噴涂法處理的豬肉保鮮期延長(zhǎng)了2 d，涂膜劑法處理的豬肉保鮮期均延長(zhǎng)了3 d，說明在TVB-N 層面上，對(duì)于鮮豬肉來說，涂膜劑法的保鮮效果更好。

2.2.3 pH 值檢測(cè)結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的凍干復(fù)溶制劑對(duì)鮮豬肉pH 值的影響見圖4。

圖4 不同質(zhì)量濃度的凍干復(fù)溶制劑對(duì)鮮豬肉pH 值的影響

新鮮肉的pH 值為5.8~6.2，次鮮肉為6.3~6.6，變質(zhì)肉大于6.7[15]。由圖4 可知，涂膜劑法處理的豬肉保鮮期均延長(zhǎng)了3 d，噴涂法處理的豬肉保鮮期均延長(zhǎng)了2 d，說明在pH 值層面上噴涂法處理的豬肉保鮮效果稍微弱。

2.2.4 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的凍干復(fù)溶制處理豬肉第3 天時(shí)的感官評(píng)價(jià)見表4。

表4 不同質(zhì)量濃度的凍干復(fù)溶制處理豬肉第3 天時(shí)的感官評(píng)價(jià)

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4798.2—2016，常溫避光保存的空白組豬肉在第2 天前后變質(zhì)，選取第3 天時(shí)對(duì)豬肉進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。根據(jù)表4 的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。由表4 可知，涂膜劑法處理的豬肉評(píng)分高，說明從感官上看，涂膜劑法處理的豬肉保鮮效果更好。

3 結(jié)論

化學(xué)類防腐劑長(zhǎng)期使用，不但會(huì)增加微生物的耐藥性，同時(shí)劑量的使用還會(huì)帶來極大安全隱患。秦桂芳等人[16]通過測(cè)定10 種中藥、2 種方劑及復(fù)配制劑，發(fā)現(xiàn)復(fù)配藥物的拮抗效果明顯高于單獨(dú)方劑，說明復(fù)配抑菌劑對(duì)致病菌抗菌作用更強(qiáng)。茍軍麗等人[17]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的工具和方法，探究甘草-石榴皮復(fù)配效果，也證明了復(fù)配藥物的優(yōu)勢(shì)。Li W H 等人[18]也進(jìn)一步證明了復(fù)方中藥創(chuàng)新利用的可行性與前景。黃芩浸提液是中醫(yī)臨床上常用的外用擦劑，藥理活性廣泛，具有多種功效，復(fù)配藥物連翹、茵陳有利于提高抑菌活性和抗氧化活性，為用作防腐劑提供理論與數(shù)據(jù)支撐。采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法，得到復(fù)配物的最佳醇提條件：料液比1∶15，提取溫度65 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，提取時(shí)間2.5 h。復(fù)配物的抑菌活性和抗氧化活性與單獨(dú)的各成分相比均有所提高，經(jīng)復(fù)配涂膜劑處理后的鮮豬肉可延長(zhǎng)保鮮期2~3 d。因此，通過連翹復(fù)配黃芩、茵陳涂膜劑藥物協(xié)同發(fā)揮作用可作為食品中的優(yōu)良的雙活性天然防腐劑應(yīng)用于食品防腐中。