3種越橘桔莖尖初代培養(yǎng)與增殖研究

范世杰 楊忠華 尹文龍

摘要： 以紅豆越橘、篤斯越桔和美登的莖尖為試材，對(duì)影響莖尖離體培養(yǎng)的取材時(shí)期、外植體的消毒、培養(yǎng)基和激素配比等因素進(jìn)行研究的結(jié)果表明：休眠期水培促萌的嫩芽污染率較低，最利于莖尖誘導(dǎo)成活。適于滅菌的處理為：紅豆越橘用75%酒精30 s+0.1%升汞2 min+次氯酸鈉4 min;篤斯越桔和美登用75%酒精滅菌30 s+0.1%升汞滅菌處理4 min+次氯酸鈉滅菌2 min。適于莖尖初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合為：紅豆越橘用WPM（改良）+6-BA 0.05 mg/L+IBA 0.5 mg/L+GA3 0.1 mg/L，誘導(dǎo)成苗率最高達(dá)84.42%;篤斯越桔、美登用WPM（改良）+6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+GA3 0.1 mg/L，成苗率分別為83.44%、92.76%。適合的增殖培養(yǎng)基組合為：紅豆越橘、篤斯越桔用WPM（改良）+ZT 1.0 mg/L+GA3為0.1 mg/L，增殖系數(shù)分別為3.90、3.72，苗高分別為2.66、2.51 cm;美登用WPM（改良）+ZT 1.2 mg/L+GA3 0.2 mg/L，增殖系數(shù)為4.59，苗高達(dá)到2.74 cm。

關(guān)鍵詞： 紅豆越橘; 篤斯越桔; 莖尖培養(yǎng); 激素; 培養(yǎng)基; 增殖

中圖分類號(hào)： S 722. 8， S 665. 9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

組織培養(yǎng)以其培養(yǎng)周期短、繁殖系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)成為了快速繁殖優(yōu)良苗木的實(shí)用技術(shù)，目前已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)、林業(yè)等領(lǐng)域[ 1 - 4 ]。而莖尖培養(yǎng)技術(shù)是培育無病毒植株、種質(zhì)資源保存、育種以及遺傳轉(zhuǎn)化等研究的有效手段[ 5 - 7 ]。 研究表明，影響植物微莖尖培養(yǎng)的因子主要有樹種和品種[ 8 ]、取材及接種時(shí)期[ 9 ]、外植體的消毒[ 10 ]、培養(yǎng)基、激素[ 11 - 13 ]以及培養(yǎng)條件等。關(guān)于越橘、篤斯越桔以及藍(lán)莓栽培種“美登”的組織培養(yǎng)已有大量報(bào)道[ 14 ]，以往主要是以葉片[ 15 ]、子葉、胚軸、腋芽和莖段[ 16 - 17 ]等為外植體，并建立了相應(yīng)的組培快繁體系，而對(duì)莖尖組織培養(yǎng)缺乏系統(tǒng)的研究。因此，本研究以紅豆越橘（Vaccinium vitis-idaea）、篤斯越桔（Vaccinium uliginosum）以及美登為試驗(yàn)材料，在不同生長期對(duì)其莖尖進(jìn)行取材，對(duì)影響莖尖誘導(dǎo)的主要因子進(jìn)行研究，旨在為3種越橘莖尖離體快繁、無病毒苗培育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

紅豆越橘、篤斯越桔材料來源于大興安嶺漠河，美登材料來源于伊春。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 取材時(shí)期對(duì)莖尖誘導(dǎo)的影響

分以下幾個(gè)時(shí)期進(jìn)行取材：（處理1）取休眠期枝條于溫室內(nèi)水培催芽，滅菌后接種;（處理2）取新梢生長初期枝條的頂端新萌發(fā)嫩芽，滅菌后接種;（處理3）取新梢生長中期的頂端嫩枝莖尖，滅菌后接種;（處理4）取盛花期的枝條頂端莖尖，滅菌后接種;（處理5）取秋季休眠前的枝條頂端莖尖，滅菌后接種。

1. 2. 2 消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)莖尖誘導(dǎo)的影響

取頂端嫩芽放入組培瓶中，滴2滴洗潔精，在自來水下沖洗30 min，然后在超凈工作臺(tái)上，用75%的乙醇溶液消毒30 s，再用無菌水沖洗2次，分別轉(zhuǎn)到0.1%升汞、2%次氯酸鈉溶液中滅菌處理2、4、6 min，然后用無菌水沖洗4～5次，最后用無菌濾紙吸干表面水分備用。

1. 2. 3 激素對(duì)莖尖誘導(dǎo)的影響

在解剖鏡下剝?nèi)?.5 mm大小的莖尖迅速接種于改良的WPM（分別用708 mg/L的 Ca（NO3）2·4H2O、202 mg/L的KNO3代替 WPM 培養(yǎng)基中的 CaCl2和K2SO4）培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中分別添加0.05、0.1、0.5 mg/L的6-BA或ZT，添加0.1、0.5、1.0 mg/L的IBA，添加0.1 mg/L的GA3。每個(gè)處理接種30個(gè)莖尖，每個(gè)處理重復(fù)3次。蔗糖 20 g/L，瓊脂 6 g/L，pH 值 5.4，培養(yǎng)溫度均為（23± 2）℃ ，光照培養(yǎng)周期為 14 h/d，光照強(qiáng)度為 2 200 Lx，其他試驗(yàn)的條件均與此相同。

1. 2. 4 培養(yǎng)基對(duì)莖尖增殖的影響

分別以MS、WPM、WPM（改良）為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別添加1.0 mg/L的ZT和0.1 mg/L的GA3，將初代培養(yǎng)存活的莖尖接種到培養(yǎng)基上。

1. 2. 5 激素對(duì)莖尖增殖的影響

將初代培養(yǎng)存活的莖尖接種到WPM（改良）培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中分別添加0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mg/L的ZT，添加0.1 、0.2 mg/L的GA3。

1. 2. 6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

接種1周后統(tǒng)計(jì)污染率，45天左右統(tǒng)計(jì)成苗率，30天統(tǒng)計(jì)莖尖苗增殖系數(shù)及苗高。

2 結(jié)果與分析

2. 1 取材時(shí)期對(duì)莖尖誘導(dǎo)的影響

由表1可見，處理1～5污染率呈升高趨勢，而莖尖誘導(dǎo)成苗率呈下降趨勢。處理1與其他處理相比有一定差異，3種越橘污染率均值較低，為6.94%;莖尖誘導(dǎo)成苗率均值較高，為85.52%，這個(gè)階段為最適宜取材時(shí)期。處理2污染率均值高于處理1，莖尖誘導(dǎo)成苗率均值與處理1無顯著差異，與處理4、5差異顯著。處理3污染率均值達(dá)到50%以上，成苗率均值為67.63%。處理4和處理5污染率均值較高，分別為77.42%和91.43%，莖尖誘導(dǎo)成苗率均值較低，分別為35.8%和11.02%。由此可見，不同取材時(shí)期莖尖污染率和誘導(dǎo)成苗率有很大的差異。

3種越橘的不同取材時(shí)期污染率和成苗率也存在一定的差異。休眠期取枝條室內(nèi)水培催芽，美登的莖尖污染率最低、成苗率最高，分別為5.62%和90.31%。在新梢生長初期取材， 美登比紅豆越橘和篤斯越桔莖尖成苗率高，為82.47%，篤斯越桔的污染率最低為18.77%。在新稍生長中期取材，紅豆越橘莖尖的污染率最低、成苗率最高，分別為42.41%和71.75%。而在盛花期和秋季休眠前取材，3種越橘莖尖的成苗率均較低，不到50%，而污染率均在70%以上。對(duì)5個(gè)取材時(shí)期結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)得出，污染率由低到高依次為休眠期枝條于溫室內(nèi)水培催芽<新梢生長初期枝條的頂端新萌發(fā)嫩芽<新梢生長中期的頂端嫩枝莖尖<盛花期的枝條莖尖<秋季休眠前的枝條頂端單芽莖尖。莖尖成苗率由高到低依次為美登藍(lán)莓﹥紅豆越橘﹥篤斯越桔。在休眠期和新稍生長初期取材，3種越橘莖尖污染率相對(duì)較低，誘導(dǎo)成苗率較高。

2. 2 消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)莖尖誘導(dǎo)的影響

由表2可見，75%乙醇與0.1%升汞、2%次氯酸鈉分別配合使用時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，污染率均值呈下降趨勢，而莖尖誘導(dǎo)成苗率均值呈先上升后下降的趨勢。同樣處理時(shí)間下，升汞與次氯酸鈉相比，莖尖污染率較低，誘導(dǎo)成苗率較高，滅菌效果較好。

將75%乙醇與升汞、次氯酸鈉共同配合使用，滅菌效果有所不同。紅豆越橘15個(gè)處理中以處理9效果最好，即先用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞滅菌處理2 min，最后用次氯酸鈉滅菌處理4 min，污染率和成苗率分別為4.65%和84.27%。篤斯越桔15個(gè)處理中以處理6效果最好，即先用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞滅菌處理4 min，最后用次氯酸鈉滅菌處理2 min，污染率和成苗率分別為1.85%和78.41%。美登15個(gè)處理中以處理6效果最好，即先用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞滅菌處理4 min，次氯酸鈉滅菌處理2 min，污染率和成苗率分別為2.40%和81.44%。

2. 3 不同激素對(duì)莖尖誘導(dǎo)的影響

將3種越橘莖尖接種到培養(yǎng)基上，10天左右莖尖泛綠，但3種越橘莖尖在含有激素ZT的培養(yǎng)基上基部多數(shù)形成愈傷組織，成苗較晚，成苗率相對(duì)較低。由表3可見，紅豆越橘不同處理間莖尖成苗率存在顯著差異，當(dāng)6-BA為0.05 mg/L、IBA為0.5 mg/L、GA3為0.1 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)成苗率最高，達(dá)84.42%;篤斯越桔不同處理間莖尖的成苗率也存在顯著差異，當(dāng)6-BA為0.1 mg/L、IBA為0.5 mg/L、GA3為0.1 mg/L時(shí)，成苗率最高，為83.44%;美登不同處理間達(dá)到差異顯著水平，當(dāng)6-BA為0.1 mg/L、IBA為0.5 mg/L、GA3為0.1 mg/L時(shí)，更利于莖尖生長，成活率可達(dá)到92.76%。不同品種莖尖生長狀況有一定的差異，美登在不同激素條件下誘導(dǎo)成苗率要高于其他兩個(gè)品種，生長更為健壯。

2. 4 培養(yǎng)基種類對(duì)莖尖增殖的影響

由表4可見，紅豆越橘、篤斯越桔、美登由莖尖誘導(dǎo)的苗分別接種到3種培養(yǎng)基上后，在WPM（改良）培養(yǎng)基上增殖系數(shù)最高，均值為3.58，苗高均值為2.78 cm，且苗較健壯，接種到WPM培養(yǎng)基上生長次之，而接種到MS培養(yǎng)基上生長最差。同一種越橘在不同培養(yǎng)基上的增殖系數(shù)、苗高均有不同差異，紅豆越橘、篤斯越桔、美登莖尖在WPM（改良）培養(yǎng)基上的增殖系數(shù)和平均苗高均較高，增殖系數(shù)分別為3.58、3.16和4.09，平均苗高分別為2.61、2.75和2.98 cm。因此從增殖系數(shù)、平均苗高等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，WPM（改良）培養(yǎng)基為3種越橘莖尖苗增殖的最佳培養(yǎng)基。

2. 5 激素對(duì)不同品種莖尖增殖的影響

將3種越橘莖尖誘導(dǎo)的苗接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)， ZT濃度對(duì)莖尖苗增殖系數(shù)影響較大，不同處理間增殖系數(shù)有一定差異。由表5可見，紅豆越橘不同處理間莖尖苗增殖存在顯著差異，當(dāng)ZT濃度為1.0 mg/L、GA3為0.1 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)最高達(dá)3.90，苗高為2.66 cm;篤斯越桔不同處理間莖尖苗也存在顯著差異，當(dāng)ZT濃度為1.0 mg/L、GA3為0.1 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)最高達(dá)3.72，苗高也能達(dá)到中等水平，為2.51 cm;對(duì)于美登各處理間達(dá)到差異顯著，當(dāng)ZT濃度為1.2 mg/L、GA3為0.2 mg/L時(shí)，更利于莖尖苗增殖，增殖系數(shù)可達(dá)4.59，苗高達(dá)到2.74 cm。不同越橘莖尖生長狀況有一定的差異，美登增殖能力要高于其他2種越橘，生長也更為健壯。

3 結(jié)論與討論

3. 1 取材時(shí)期對(duì)莖尖污染率、誘導(dǎo)成活率影響較大。紅豆越橘、篤斯越桔和美登在休眠期室內(nèi)水培后萌發(fā)出的嫩芽污染最低，這個(gè)階段可顯著降低接種的污染率，提高莖尖誘導(dǎo)成苗率，為最適宜取材時(shí)期。新梢生長中期、盛花期以及秋季休眠前的枝條頂端莖尖，由于長時(shí)間暴露在室外，接種污染率較高，莖尖分生組織分化相對(duì)緩慢，莖尖誘導(dǎo)成苗率也較低，應(yīng)盡量避免在這些時(shí)期取材。

3. 2 在莖尖培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基是影響莖尖成活率以及苗木狀態(tài)的主要因素之一，紅豆越橘、篤斯越桔和美登在WPM（改良）培養(yǎng)基上增殖系數(shù)大、生長健壯，在MS培養(yǎng)基上生長最差，莖尖誘導(dǎo)成苗率也較低。

3. 3 植物激素是影響莖尖誘導(dǎo)和增殖的關(guān)鍵因子之一，在組織培養(yǎng)中起著重要作用[ 18 ]。對(duì)3種越橘的研究表明，在莖尖誘導(dǎo)成苗過程中6-BA和IBA起著主要作用。在莖尖苗增殖過程中ZT起著關(guān)鍵的作用[ 19 - 20 ]，ZT濃度在0.5～2.0 mg/L的范圍內(nèi)3種越橘莖尖苗的增殖系數(shù)均呈先升高后下降的趨勢，不同種的越橘達(dá)到最高增殖系數(shù)時(shí)所需的ZT濃度不同。當(dāng)ZT濃度高于0.8 mg/L時(shí)，愈傷組織并未發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，這與趙新宇（2015）[ 17 ]對(duì)藍(lán)莓的研究結(jié)果一致，與劉樹英（2002）[ 21 ]對(duì)兔眼越橘的研究不同。

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第1作者簡介： 范世杰（1963-）， 男， 高級(jí)工程師。

收稿日期： 2018 - 03 - 20

（責(zé)任編輯： 張亞楠）