鴨兒芹的化學(xué)成分及對(duì)Hep G2細(xì)胞毒性

劉安韜 張婷 梁杏梅

摘 要：該研究采用大孔樹脂（D101）、硅膠、羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20）和十八烷基硅烷鍵合硅膠 （ODS）等色譜方法，對(duì)鴨兒芹的化學(xué)成分進(jìn)行了分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)、質(zhì)譜和核磁共振波譜數(shù)據(jù)，并參考相關(guān)文獻(xiàn)綜合分析化合物結(jié)構(gòu)，進(jìn)而采用噻唑藍(lán)（MTT）法，對(duì)鴨兒芹化合物抗Hep G2細(xì)胞活性進(jìn)行篩選。結(jié)果表明：共從鴨兒芹中分離鑒定了7個(gè)化合物，分別為p-（acetylamino）phenol（1），辛酸甲酯（2），丁酸異戊酯（3），N，N-二甲基-苯并咪唑-2胺（4），5-羥基-1-（4-羥基-3-甲氧苯基）庚3酮（5），3，5二丁基六氫吡咯里嗪（6），（S）-4-（1-hydroxyallyl）phenyl acetate（7）。其中，化合物6對(duì)細(xì)胞具有抑制作用，抑制率達(dá)到89.1%。該研究結(jié)果表明化合物1-7均為首次從鴨兒芹中分離得到，其中化合物6對(duì)Hep G2細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，且具有劑量依賴性。

關(guān)鍵詞：鴨兒芹， 化合物， 抗腫瘤活性

中圖分類號(hào)：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2018）04-0469-06

Abstract：Chemical constituents of Cryptotaenia japonica were separated and purified by macroporous resin D101， silica gel chromatography， Sephadex LH-20 and octadecylisilyl（ODS）. Component structures were identified by physical and chemical properties， using spectral analysis included MS and NMR. MTT method was used to evaluate anti-tumor activities of chemical components. The results were as follows：Seven constituents were obtained from C. japonica. The structures were identified as p-（acetylamino）phenol（1）， methyl caprylate（2），isopentyl butyrate（3）， N，N-dimethyl-1H-benzo [d]imidazol-2-amine（4），5-hydroxy-1-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）heptan-3-one（5），（3R*，5S*，7aR）-3，5-dibutylhexahydro-1H-pyrrolizine（6）， （S）-4-（1-hydroxy-allyl）phenyl acetate（7）. Componds 1-7 were obtained for the first time from C. japonic. Component 6 showed significant inhibitory effect against Hep G2 with the inhibition ratio 89.1% and had dose-dependent effect.

Key words：Cryptotaenia japonica， compond， anti-tumor activity

鴨兒芹（Cryptotaenia japonica）為傘形科植物鴨兒芹的全草，又名三葉芹、鴨腳板草、野芹菜等。在全國(guó)各地均有廣泛的分布（中國(guó)科學(xué)院植物研究所，1985）。鴨兒芹具有消炎解毒、活血消腫的功效，主治肺炎、肺膿腫、淋病、感冒咳嗽、跌打損傷，外用治皮膚瘙癢等病癥（江蘇新醫(yī)學(xué)院，1977）。鴨兒芹中含有黃酮類化合物（李長(zhǎng)生等，2006；李勝華和牛友芽，2012）和揮發(fā)油類成分（江豐等，2006），揮發(fā)性萜類化合物，占總揮發(fā)性成分的82.37%（瞿萬云等，2003）。鴨兒芹提取物有著較廣泛的藥理活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其具有清咽（高敏等，2005），保肝降酶等作用（田琳和龔其海，2008；李娟等，2012）。

本研究運(yùn)用大孔樹脂（D101），硅膠，羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20），十八烷基硅烷鍵合硅膠 （ODS）等色譜方法，對(duì)鴨兒芹的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，從中分離鑒定了7個(gè)化合物，分別為p-（acetylamino）phenol（1），辛酸甲酯（2），丁酸異戊酯（3），N，N-二甲基-苯并咪唑-2胺（4），5-羥基-1-（4-羥基-3-甲氧苯基）庚3酮（5），3，5二丁基六氫吡咯里嗪（6），（S）-4-（1-hydroxyallyl）phenyl acetate（7）?；衔?-7均為首次從鴨兒芹中分離得到，進(jìn)而采用四氯唑鹽還原（MTT）法，對(duì)鴨兒芹的化合物抗Hep G2細(xì)胞活性進(jìn)行篩選，化合物6對(duì)細(xì)胞具有抑制作用，且具有劑量依賴性。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

R3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琪有限公司），AV-400 型核磁共振光譜儀（德國(guó) Bruker公司），1100 Series LC/MSD Trap質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent 公司），XR6A型顯微熔點(diǎn)儀（上海光學(xué)儀器一廠），Sephadex LH-20（美國(guó)Pharmacia公司），薄層色譜硅膠預(yù)涂板（青島裕民源硅膠試劑廠），ODS（80Bin，YMC，日本Merck公司），柱色譜硅膠（80～100，300～400目，青島裕民源硅膠試劑廠），MR-96A型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞公司），CJ-1F型醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司），3111 型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)熱電（賽默飛世爾）公司），臺(tái)式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司），DMIL倒置顯微鏡（德國(guó) Leica）。

人肝癌細(xì)胞株Hep G2，購自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板購自Corning公司。噻唑藍(lán)（3- [4，5-dimethylthiazol-2yl]-2，5-diphenyltetrazoliumbromide， MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；青霉素、 鏈霉素購自Invitrogen公司，DMEM 培養(yǎng)基購自GIBCO公司，胎牛血清購自 Hyclone 公司。鴨兒芹植物樣本于2014年3月至2015年5月采自廣西桂林雁山區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)廖月葵高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為傘形科植物鴨兒芹（Cryptotaenia japonica）。

1.2 方法

1.2.1 提取和分離 首先取鴨兒芹干燥藥材粗粉約5 kg，60%乙醇加熱回流提取3次，每次3 h，過濾合并提取液，濃縮，回收乙醇獲得浸膏980 g。然后浸膏混懸于水溶液中分別用石油醚，氯仿，醋酸乙酯，正丁醇進(jìn)行萃取，回收溶劑得到石油醚部分浸膏29.44 g，氯仿部分浸膏48.6 g、乙酸乙酯部分浸膏57.9g、正丁醇部分浸膏230 g。最后水溶液部位過大孔樹脂D101，用水洗脫后，用95%乙醇洗脫，洗脫液減壓回收乙醇，真空干燥，獲得水溶性部分浸膏約535.5 g。

正丁醇部分經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（9∶1、8∶2）甲醇-乙酸乙酯（14∶1、12∶1）洗脫，共分得7個(gè)部分，各部分繼續(xù)用氯仿-甲醇為流動(dòng)相硅膠柱色譜分離，經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20柱色譜、ODS柱色譜分離純化得到化合物1（43.1 mg）。

乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿-乙酸乙酯（50∶1、10∶1、1∶1），氯仿-甲醇（10∶1、1∶1）乙酸乙酯-甲醇（1∶5、1∶1）洗脫，共分成8個(gè)部分，其中1～5部分經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20柱色譜，ODS柱色譜分離純化得到化合物2（50 mg）、化合物3（17.5 mg）、化合物4（95 mg）、化合物5（51 mg）、化合物6（61.8 mg）、化合物7（9 mg）。

1.2.2 抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞株用含10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換一次液， 用0.25%胰蛋白酶消化傳代。在Leica顯微鏡下觀察加藥前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，制成 2×104～3×104個(gè)·mL-1單細(xì)胞懸液，接種于 96 孔板，每孔200 μL，每組設(shè)3個(gè)平行孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后分別加入不同濃度的樣品。另設(shè)陰性對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。實(shí)驗(yàn)終止前4 h，每孔加入濃度為1 mg·mL-1的MTT 50 μL， 4～6 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 100 μL，震蕩5 min，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。按公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率：抑制率（Inhibitory Rate，IR%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%，用SPSS 18.0，計(jì)算抑制50%細(xì)胞生長(zhǎng)的樣品濃度，以IC50表示。

2 結(jié)構(gòu)鑒定與抗腫瘤活性測(cè)試

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定 圖1

化合物1 白色結(jié)晶。FAB-MS m/z：167.16，分子式為C8H9NO3。1H-NMR （600 MHz，CD3OD） δ：3.68 （3H， s，-OCH3），7.38（2H，dd，J=7.5，1.5Hz，H-3，5），6.73（2H，dd，H-2，4），9.97（1H，s，H-NH），9.94（1H，s，-OH）。13C-NMR （600MHz，CD3OD） δ：172.87（C=O），131.4（C- 4），116.70 （C-2，C-4），124.54 （C-3，C-5），154.8（C-5），23.84（-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與Lewis et al（2003）報(bào)道一致，推斷化合物1為p-（acetylamino）phenol。

化合物2 白色脂肪狀。FAB-MS m/z：15813，分子式為C9H18O2。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：0.88（3H，d，J=8.0Hz，H-1），1.26（2H，dd，J=7.1，8.0Hz，H-2），1.26（2H，s，J=7.1Hz，H-3），1.26（2H，dd，J=7.1Hz，H-4），1.33（1H，s，J=7.1Hz，H-5），1.66（2H，s，H-6），2.32（2H，dd，H-7），3.61（3H，s，H-OCH3）。13C-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：13.28（C-1），22.39（C-2），31.7（C-3），28.82（C-4，5），24.67（C-6），33.61（C-7），78.05（C-8），50.94（C-OCH3），174.4（C=O）。以上數(shù)據(jù)與Chinta et al（2016）報(bào)道一致，推斷化合物2為辛酸甲酯。

化合物3 淡黃色粉末。FAB-MS m/z：158.13，分子式為C9H18O2。1H-NMR （600 MHz，CD3OD） δ：0.99（3H，d，J=8.0Hz，H-1），0.97（6H，d，J=8.0Hz，H-8，9），4.13（2H，d，J=7.1Hz，H-3），2.32（1H，d，J=7.1Hz，H-5），1.81（1H，m，H-7），1.68（2H，m，H-2），1.52（2H，m，H-6）。13C-NMR （600MHz，CD3OD）δ：13.09（C-1），28.81（C-8，C-9），22.32（C-2），33.66（C-5），31.64（C-3），24.7（C-7），176.71（C-4），115.58（C-6），175.0（C=O）。以上數(shù)據(jù)推斷，故鑒定化合物3為丁酸異戊酯。

化合物4 淡黃色粉末。FAB-MS m/z：161.1，分子式為C9H11N3。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：12.40（1H，s，J=8.0Hz，H-2），3.06（6H，s，H-CH3），7.12（4H，d，J=7.5，1.5Hz，H-4，5，6，7）。13C-NMR （600MHz，CD3OD）δ：170.13（C-2），153.28 （C-4a），130.27（C-7a），122.1（C-6），122.4（C-7），114.84（C-4），22.12（C-CH3），22.12（C-CH3）。以上數(shù)據(jù)與Benassi et al（2010）報(bào)道一致，鑒定化合物4為N，N-二甲基-苯并咪唑-2胺。

化合物5 淡黃色油滴。FAB-MS m/z：252.14，分子式為C14H20O4。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：9.96（1H，s，J=8.0Hz，H-4′-OH），6.77（1H，s，H-5-OH），6.59（1H，d，J=8.5Hz，H-6′），6.64（2，dd，J=8.5，1.5Hz，H-5′），6.78（1H，d，J=1.5Hz，H-2′），3.72（1H，m，J=7.0Hz，H-5），3.77（3H，s，H-3′-OCH3），2.80（2H，d，H-2），2.71（2H，m，H-4），2.78（2H，d，H-1），1.46（2H，m，H-6），0.89（3H，d，H-7）。13C-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：28.96（C-1），31.87（C-2），178.44（C-3），33.88（C-4），73.32（C-5），29.56（C-6），14.12（C-7），133.09（C-1′），113.21（C-2′），150.50（C-3′），171.33（C-4′），116.46（C-5′），121.98（C-6′），37.26（C-OCH3）。 從以上數(shù)據(jù)推斷， 故鑒定化合物5為5-羥基-1-（4-羥基-3-甲氧苯基）庚3酮。

化合物6 淡黃色粉末。FAB-MS m/z：224.23，分子式為C15H29N。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：2.25（2H，m，J=8.0Hz，H-3，5），2.25（1H，m，H-8），1.66（4H，m，H-1，2，6，7），1.41（4H，m，H-1，2，6，7），1.31（4H，m，H-9，9′），1.25（4H，m，H-10，10′），1.31（4H，m，H-11，11′），0.88（6H，m，H-12，12′）。13C-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：29.07（C-1，7），29.25（C-2，6），31.94（C-3，5），33.94（C-8），29.60（C-9，9′），29.69（C-10，10′），24.70（C-11，11′），22.7（C-12，12′），14.13（C-13，13′）。從以上數(shù)據(jù)推斷，故鑒定化合物6為（3R，5S，7ar）-3，5-dibutylhexahydro-1H-pyrrolizine（3，5二丁基六氫吡咯里嗪）。

化合物7 淡白色結(jié)晶。FAB-MS m/z：192.08，分子式為C11H12O3。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：5.12（1H，s，J=8.0Hz，H-7-OH），7.21（2H，d，J=8.2Hz H-2，6），7.28（2H，d，J=8.2 Hz H-3，5），5.56（1H，d，H-7），2.31（3H，s，H-CH3），6.30（1H，d，J=12.2Hz，H-8），5.00（1H，d，J=12.2Hz ，H-9），4.99（1H，m，H-9）。13C-NMR（600MHz，CD3OD）δ：121.97（C-1），78.10（C-2，6），78.10（C-3，5），114.82（C-4），77.58（C-7），114.82 （C-8），77.84（C-9），169.95（C-CO），22.2（C-CH3），以上數(shù)據(jù)推斷，故鑒定化合物7為（S）-4-（1-hydroxyallyl）phenyl acetate。

2.2 抗腫瘤活性測(cè)試

細(xì)胞藥理篩選結(jié)果（表1）表明，在7個(gè)化合物中，其中化合物6對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用， 抑制率達(dá)到89.1%，可以使Hep G2細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞碎片增多，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變，并且具有劑量依賴性。IC50濃度為（52.31±4.77）μg·mL-1，在得到的所有化合物中對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用最為明顯。

3 討論與結(jié)論

通過對(duì)鴨兒芹化學(xué)成分進(jìn)行提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定，確證7個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，均為首次從鴨兒芹植物中分離得到的?；衔?對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，抑制率達(dá)到89.1%，可以使Hep G2 細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞碎片增多，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變，并且具有劑量依賴性。 IC50濃度為（52.31±4.77）μg·mL-1，在得到的所有化合物中對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用最為明顯。

化合物6為雙吡咯分子的雜環(huán)化合物，該類結(jié)構(gòu)（顏文革和張守芳，2000）首先發(fā)現(xiàn)于吡咯里西啶生物堿分子中，該類化合物在新藥開發(fā)上是一個(gè)相當(dāng)活躍的研究領(lǐng)域，相信化合物6為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和修飾，可能發(fā)現(xiàn)新的具有抗癌作用的藥物。

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