枳殼藥材揮發(fā)油的GC—MS指紋圖譜研究

劉清茹 譚偉民 文詩泳 肖幸華 陳婷 郭英 曾曉艷 劉塔斯

中圖分類號 R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）04-0461-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.04.08

摘 要 目的：建立枳殼藥材揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）指紋圖譜。方法：采用GC-MS法，色譜柱為RTX-5MS毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為高純氦氣（≥99.999%），流速為1.0 mL/min，分流比為10 ∶ 1，進(jìn)樣量為1 μL（程序升溫）；采用電子轟擊離子源，離子源溫度為230 ℃，檢測器溫度為250 ℃，溶劑延遲時(shí)間為3 min，掃描范圍為m/z 35～550。以月桂烯為參照，測定21批藥材揮發(fā)油樣品的GC-MS圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）進(jìn)行相似度評價(jià)，確定共有峰，采用LC Solution 2質(zhì)譜庫（NIST05.LIB和NIST05s.LIB）確定共有峰成分，并采用面積歸一化法測定共有峰的相對含量。結(jié)果：21批藥材揮發(fā)油樣品的GC-MS圖譜有20個(gè)共有峰，相似度均>0.90；經(jīng)驗(yàn)證，21批藥材揮發(fā)油樣品GC-MS圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性。枳殼藥材揮發(fā)油主要成分為檸檬烯、萜品烯、月桂烯和D-Cadinene。結(jié)論：所建指紋圖譜可為枳殼藥材揮發(fā)油的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞 枳殼；揮發(fā)油；氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜；道地藥材

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish GC-MS fingerprint of volatile oil from Citrus aurantium. METHODS： GC-MS method was adopted. The determination was performed on RTX-5MS capillary column with injector temperature of 250 ℃， high pure helium as carrier gas（≥99.999%）， flow rate of 1.0 mL/min， split ratio of 10 ∶ 1， and sample size of 1 μL （temperature programming）. Mass spectrum condition included electron bombardment ion source， ion source temperature of 230 ℃， detector temperature of 250 ℃， 3 min solvent delay， scanning range of m/z 35-550. GC-MS chromatograms of 21 batches of volatile oil samples were determined using Laurene as reference. The similarity of them was evaluated by using TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A edition）， and common peak was determined. The components of common peak were determined by LC Solution 2 mass database （NIST05.LIB and NIST05s.LIB）. Relative content of common peak was determined with area normalization. RESULTS： There were 20 common peaks in GC-MS chromatograms of 21 batches of volatile oil samples， and the similarity was higher than 0.90. After validation， GC-MS chromatograms of 21 batches of volatile oil samples were in good agreement with control fingerprint. The main constituents of the volatile oil of C. aurantium were Limonene，Terpinene， Laurene and D-Cadinene. CONCLUSIONS： Established fingerprint can provide reference for identification and quality evaluation of volatile oil of C. aurantium.

KEYWORDS Citrus aurantium； Volatile oil； GC-MS fingerprint； Genuine regional drug

枳殼為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)[1]，有理氣寬中之功效，多用于食積不化、脘腹脹滿等癥狀[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枳殼具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗?jié)?、減少毛細(xì)血管脆性等作用[3]。

我國枳殼藥材3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)為湖南沅江、江西新干和重慶江津，市場多以藥材出處加以區(qū)分，分別稱為湘枳殼、江枳殼和川枳殼。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，主要用于評價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性[4-5]。現(xiàn)有研究對枳殼藥材的氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）指紋圖譜報(bào)道較少，本試驗(yàn)收集了全國不同產(chǎn)地的21批枳殼藥材，采用GC-MS法建立了其揮發(fā)油指紋圖譜，旨在為枳殼藥材的鑒別和中成藥的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

QP2010GC型GC-MS儀（日本Shimadzu公司）；FW- 117型中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；FA- 1604型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

枳殼藥材購自或采自不同省區(qū)（見表 1），經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉塔斯教授鑒定為真品（表中，“/”為未知）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 GC條件 色譜柱：RTX-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，載氣：高純氦氣（≥99.999%）；流速：1.0 mL/min，分流比為10 ∶ 1，進(jìn)樣量：1 μL。程序升溫：初始溫度60 ℃，以4 ℃/min速度升至80 ℃；以1 ℃/min速度升至81 ℃，保持4 min；以2 ℃/min速度升至86 ℃；以10 ℃/min速度升至140 ℃；以1 ℃/min速度升至144 ℃，保持2 min；以1 ℃/min速度升至154 ℃；以2 ℃/min速度升至166 ℃；以10 ℃/min速度升至245 ℃；以4 ℃/min速度升至263 ℃。

2.1.2 MS條件 離子源：電子轟擊離子源；離子源溫度：230 ℃；檢測器溫度：250 ℃；溶劑延遲時(shí)間：3 min；掃描范圍： m/z 35～550。

2.2 供試品溶液的制備

取藥材樣品粉末（過3號篩） 50 g，置于圓底燒瓶中，加水550 mL，浸泡30 min，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“2204揮發(fā)油測定法”甲法提取[6]，提取5 h后，停止加熱，放冷1 h，將水緩慢放出，至油層上端到達(dá)0刻度線以上 5 mm 處為止。將揮發(fā)油以無水硫酸鈉脫水，靜置過夜，得揮發(fā)油粗品，精密量取0.05 mL，加乙酸乙酯定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得，冷藏，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S5）適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣6次測定，以月桂烯峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，20個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD<1.0%（n=6），相對峰面積的RSD<0.5%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S5）適量，分別于放置0、2、6、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣測定，以月桂烯峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，20個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD<2.3%（n=6），相對峰面積的RSD<3.0%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批藥材樣品（編號：S5）適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，以月桂烯峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，20個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD<1.9%（n=6），相對峰面積的RSD<1.6%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 GC-MS指紋圖譜的生成及相似度、共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析

2.4.1 GC-MS指紋圖譜的生成 取21批藥材樣品各適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004 A 版）對21批藥材揮發(fā)油樣品的GC-MS圖譜進(jìn)行分析，得GC-MS指紋圖譜，詳見圖1[圖中，“R”為對照藥材（編號：S5）]、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對21批藥材揮發(fā)油樣品的GC-MS圖譜進(jìn)行比較分析，詳見表2。結(jié)果顯示，21批枳殼藥材揮發(fā)油樣品GC-MS圖譜的相似度均較好（相似度>0.90），且與對照藥材指紋圖譜具有較好的一致性，表明各樣品間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

2.4.3 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 對圖2進(jìn)行分析，結(jié)果共確定20個(gè)共有峰（保留時(shí)間見表3）。其中，4號峰為月桂烯，為所有樣品共有。因此，以其為參照峰，計(jì)算其他共有峰相對于4號峰的相對峰面積，詳見表4。

2.4.4 共有峰成分的鑒定 由圖2、表3、表4可得20個(gè)共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)，通過檢索LC Solution 2工作站標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫（NIST05.LIB和NIST05s.LIB）對比相關(guān)圖譜，及對比相關(guān)文獻(xiàn)資料[7-9]，鑒定出月桂烯、檸檬烯、萜品烯等20個(gè)共有峰成分，詳見表5。

2.4.5 不同產(chǎn)地藥材揮發(fā)油樣品GC-MS圖譜共有峰成分相對含量比較 取不同產(chǎn)地藥材揮發(fā)油樣品各適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，得 GC-MS圖譜，采用峰面積歸一化法對其進(jìn)行積分，得各共有峰成分相對含量，詳見表6。

3 討論

本試驗(yàn)對21批枳殼藥材揮發(fā)油樣品進(jìn)行了GC-MS分析，通過指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)21批樣品的相似度均較好，但仍可以看出湘枳殼與江枳殼藥材揮發(fā)油樣品相似度更高，說明地緣關(guān)系比較近，枳殼藥材揮發(fā)油樣品相對比較穩(wěn)定，變異較小。

通過對湘枳殼藥材（沅江市S5、安仁縣S8、盒杉鄉(xiāng)S20）揮發(fā)油樣品共有峰成分相對含量比較，發(fā)現(xiàn)沅江市產(chǎn)枳殼藥材的揮發(fā)油樣品中間異丙基甲苯、羅勒烯、萜品烯、蒈烯、4-萜烯醇、α-松油醇、α-萜品烯、二十五烷、1-石竹烯、D-Cadinene、亞油酸甲酯、（-）-β-Elemene相對含量較高；安仁縣產(chǎn)枳殼藥材揮發(fā)油樣品中月桂烯、β-蒎烯、α-蒎烯相對含量較高；盒杉鄉(xiāng)產(chǎn)枳殼藥材揮發(fā)油樣品中檸檬烯相對含量最高，但其他成分相對含量較沅江市和安仁縣低。結(jié)果表明，沅江市產(chǎn)區(qū)是湘枳殼藥材道地產(chǎn)區(qū)，有400多年栽培歷史，揮發(fā)油種類較多且含量相對較高，藥材較大，氣味醇濃。

通過對不同產(chǎn)地枳殼藥材（安徽S2、海南S4、湖南S5、重慶S9、陜西S14、江西S16）揮發(fā)油樣品共有峰成分相對含量比較，發(fā)現(xiàn)湘枳殼、江枳殼藥材揮發(fā)油樣品中月桂烯、檸檬烯相對含量較高；川枳殼藥材揮發(fā)油樣品中β-蒎烯相對含量較高；而安徽產(chǎn)枳殼藥材揮發(fā)油樣品中間異丙基甲苯、D-Cadinene、（-）-β-Elemene、1-石竹烯、亞油酸甲酯相對含量較高；海南產(chǎn)枳殼藥材揮發(fā)油樣品中α-萜品烯相對含量較高；陜西產(chǎn)枳殼藥材揮發(fā)油樣品中萜品烯、反-α，α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇、蒈烯、α-松油醇相對含量較高。

通過對飲片（S2）、藥材（S5）與炮制藥材（S13）共有峰成分含量比較，發(fā)現(xiàn)枳殼飲片揮發(fā)油樣品中間異丙基甲苯、D-Cadinene、（-）-β-Elemene、1-石竹烯、亞油酸甲酯相對含量較枳殼藥材和炮制藥材揮發(fā)油樣品高；分析原因可能是飲片經(jīng)過切片干燥后，主要成分檸檬烯揮發(fā)丟失，使得其他成分的相對含量增加；炮制品比未炮制藥材揮發(fā)油樣品中β-蒎烯、α-蒎烯、α-水芹烯、檸檬烯相對含量高，分析原因可能是藥材經(jīng)炮制后烯類成分增加。

枳殼藥材揮發(fā)油主要成分為檸檬烯、萜品烯、月桂烯和D-Cadinene。湘枳殼、江枳殼品質(zhì)較佳，主要原因?yàn)槠渲饕钚猿煞謾幟氏┹^其他產(chǎn)地含量高。

綜上所述，所建指紋圖譜可為枳殼藥材的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價(jià)提供參考。

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（收稿日期：2017-04-28 修回日期：2017-07-01）

（編輯：張 靜）