一株好氧反硝化菌的篩選及其脫氮性能研究

張崢 黃家富 覃華靜 黃雪容 鄧冬梅

摘 要：從柳鋼焦化廢水A/O生物處理系統(tǒng)的好氧活性污泥中篩選分離出一株具有好氧反硝化能力的菌株f-3.生理生化特征以及16S rDNA序列分析表明，f-3屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）.在通過單因素法考察初始 pH 值、溫度、碳氮比（C/N）、投菌量和不同碳源等環(huán)境條件對f-3反硝化性能影響的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法確定f-3進(jìn)行反硝化反應(yīng)的最優(yōu)環(huán)境條件.結(jié)果表明：在硝酸鉀為唯一氮源、35 ℃、NO3-初始濃度180 mg/L、C/N 10∶1、初始pH 6.0、投菌量2%時，f-3菌株的反硝化性能最優(yōu)，36 h對NO3-去除率達(dá)92.85%；在亞硝酸鈉為唯一氮源、NO2-初始濃度280 mg/L、初始pH 4.0、C/N 15∶1、溫度35 ℃時，f-3菌株對NO2-降解率最大，36 h對NO2-去除率達(dá)68.45%；此外，該菌株在400 mg/L苯酚或400 mg/L喹啉中均能生長，且保存一定的好氧反硝化能力，說明f-3菌株對焦化廢水中主要污染物苯酚和喹啉具有一定耐性.

關(guān)鍵詞：焦化廢水；好氧反硝化作用；菌株；功能篩選

中圖分類號：X757 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2018.04.008

0 引言

焦化廢水是指在煤的高溫干餾、煤氣凈化及化工產(chǎn)品精制過程中所產(chǎn)生的廢水，成分復(fù)雜，是目前最難處理的工業(yè)廢水之一[1-2].生物處理法是目前焦化企業(yè)應(yīng)用最廣泛和成熟的廢水處理技術(shù)[3-4].焦化廢水中除大量的酚類、聯(lián)苯和喹啉等難降解有毒污染物外，還有大量氨氮.硝化反硝化組成的脫氮系統(tǒng)由于難降解有機(jī)物等環(huán)境影響，抗負(fù)荷沖擊能力差，出水氨氮不穩(wěn)定，不能穩(wěn)定達(dá)到（GB16171-2012）《煉焦化學(xué)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》中焦化廢水排放標(biāo)準(zhǔn).為此，穩(wěn)定高效的硝化和反硝化功能是目前焦化廢水生物處理的主要目標(biāo)之一.篩選脫氮效率高的菌種，并通過生物強(qiáng)化方式將其應(yīng)用于焦化廢水生物處理，是提高焦化廢水生物脫氮效率的主要途徑之一.

好氧反硝化菌是一種新型反硝化菌，主要存在于芽孢桿菌屬（Bacillus）、副球菌屬（Paracoccus）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等，多數(shù)為好氧或兼性好氧、并以有機(jī)碳作為能源的異養(yǎng)硝化菌[5].目前，鑒定新的好氧反硝化菌并考察其反硝化特性是好氧反硝化菌的研究熱點.在焦化廢水生物處理的活性污泥中，也已發(fā)現(xiàn)有好氧反硝化菌的存在，但目前鑒定出能實現(xiàn)焦化廢水脫氮的好氧反硝化菌數(shù)量很少.因此，本研究希望能夠從焦化廢水好氧活性污泥中篩選出具有高效好氧反硝化能力的菌種，并使用分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定其種屬，并考察環(huán)境因子對其反硝化能力的影響，可為以后對好氧反硝化菌的各種生長特性和脫氮機(jī)理進(jìn)行深入研究提供材料，為將其應(yīng)用于焦化廢水生物脫氮提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株篩選自柳鋼焦化廢水缺氧/好氧（A/O）生物處理系統(tǒng)的O池中活性污泥.

1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌富集培養(yǎng)使用溴百里酚藍(lán)（BTB）固體培養(yǎng)基，包含瓊脂20 g/L、KNO3 1 g/L、KH2PO4 1 g/L、FeC13·6H2O 0.5 g/L、CaC12·7H2O 0.2 g/L、MgC12·7H2O 1 g/L、琥珀酸鈉8.5 g/L、溴百里酚藍(lán)（BTB）0.01 g/L、pH 7.0～7.3.當(dāng)細(xì)菌發(fā)生反硝化反應(yīng)時，培養(yǎng)基pH增加，當(dāng)pH>7.6時，培養(yǎng)基變藍(lán)色[6].

細(xì)菌反硝化性能測定用反硝化培養(yǎng)基A和反硝化培養(yǎng)基B.反硝化培養(yǎng)基A包含KNO3 0.72 g/L，KH2PO4 1 g/L，琥珀酸鈉2.8 g/L.反硝化培養(yǎng)基B包含NaNO2 0.6 g/L，KH2PO4 1 g/L，琥珀酸鈉2.8 g/L.

1.3 菌種的篩選、分離和保存

取1 mL污泥與9 mL無菌水在錐形瓶中混合震蕩，使污泥充分搖碎.破碎后的污泥經(jīng)梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 稀釋，涂布于BTB培養(yǎng)基，恒溫箱30 ℃培養(yǎng)36 h.使用BTB固體培養(yǎng)基對已長出的菌落進(jìn)行平板劃線分離.將分離純化出菌株分別接入反硝化培養(yǎng)基A、B中，150 r/min，28 ℃培養(yǎng)48 h后，分別用酚二磺酸光度法和N- （1-萘基） -乙二胺光度法測定硝酸氮（NO3-N）和亞硝酸氮（NO2-N）[7].篩選到反硝化能力最強(qiáng)的菌株（f-3號菌株）.將純化的f-3號菌保存在15%的甘油中，存于-60 ℃冰箱中待用.

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)和生理生化實驗

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，并利用溫度生長、鹽度生長、氧化酶、接觸酶、甲基紅、吲哚和淀粉分解等實驗鑒定菌株生理特性[8].

1.4.2 菌株16S rRNA 鑒定

利用細(xì)菌鑒定的通用引物27F 和1492R[9-10]對菌液進(jìn)行PCR 片段基因擴(kuò)增，引物由上海生工有限公司合成.反應(yīng)體系（50 μL）包括：25 μL DNA 聚合酶mix（賽默飛公司，美國），菌液模板4 μL，去離子水17 μL，上下游引物各2 μL.PCR溫度程序為：94 ℃預(yù)變性8 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)29次，最后72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存.1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（康寧生命科學(xué)有限公司，中國）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化.將純化的DNA送往上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定；將序列在NCBI網(wǎng)頁上進(jìn)行BLAST同源性比對.

1.5 菌株生長曲線和好氧反硝化特性

1.5.1 生長曲線分析

菌株經(jīng)BTB液體培養(yǎng)基活化20 h后按1% 接種量接至50 mL BTB培養(yǎng)基中，于30 ℃和150 r /min 條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每隔4 h取樣，測定OD600，繪制生長曲線.

1.5.2 反硝化性能分析

根據(jù)單因素實驗設(shè)計，將f-3菌株置于不同碳源種類、碳氮比、溫度、pH和投菌量等條件下，在BTB液體培養(yǎng)基150 r/min條件下培養(yǎng)不同時間后，取出部分菌液在10 000 r /min 下離心5 min，分析上清液中NO3-N和NO2-N的濃度，計算NO3-N和NO2-N去除率.本次實驗采用單因素分析法.根據(jù)環(huán)境單因素實驗結(jié)果，用Design-Expert軟件生成三水平三因素組合條件（如表1所示），然后用spss軟件處理數(shù)據(jù)，計算F（方差）等指標(biāo)，根據(jù)所生成的各組合條件搖床培養(yǎng)菌株，測定培養(yǎng)40 h后f-3菌株對NO3-N和NO2-N的去除率，進(jìn)一步優(yōu)化f-3菌株的環(huán)境條件，以期獲得更好的反硝化性能.

1.6 苯酚和喹啉對f-3菌株反硝化性能影響

配制含有不同濃度苯酚或喹啉的BTB液體培養(yǎng)基，按2%的接種量接種f-3菌株，并在1.5.2中最優(yōu)條件下培養(yǎng)，每隔6～8 h取樣，離心測上清中的NO3-N和NO2-N濃度，計算NO3-N和NO2-N去除率.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選

利用BTB培養(yǎng)基初篩時，對菌落周圍出現(xiàn)較大藍(lán)色暈圈的菌落分離純化，得到6株菌株，菌株形態(tài)見表2.

將分離純化出的6株菌在分別接入反硝化培養(yǎng)基A、B中，30 ℃培養(yǎng)36 h后，測定其對NO3-N和NO2-N的降解率.如表2所示，在起始NO3-N濃度為233.4 mg/L時，6株菌對NO3-N 降解率均達(dá)80%以上，其中，f-3與f-5菌株對NO3-N降解能力最強(qiáng)；6株菌中f-3菌株降解NO2-N能力最強(qiáng)，NO2-N降解率達(dá)48%.由于6株菌中，f-3菌株具有較高的NO3-N和NO2-N降解能力，后續(xù)試驗以f-3菌株為材料進(jìn)行.

2.2 f-3菌株鑒定和生理生化

如圖1所示，f-3菌株革蘭氏陰性，在BTB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落圓形濕潤，可以使BTB培養(yǎng)基變藍(lán).Blast 結(jié)果表明：f-3菌株的16S rRNA 基因序列同Pseudomonas pseudoalcaligenes的相似度最大為99%，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化實驗結(jié)果（見表3），可以基本確定f-3菌株屬于P. pseudoalcaligenes.目前已發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化菌，如Pseudomonas chengduensis[9]、Pseudomonas aeruginosa，均屬于Pseudomonas屬，但Pseudomonas pseudoalcaligenes具有反硝化特性尚未見報道.

2.3 f-3菌株生長曲線

如圖2所示，在液體BTB培養(yǎng)基中，150 r/min和30 ℃條件下，f-3菌株從4 h左右開始進(jìn)入對數(shù)期，12 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，28 h左右開始進(jìn)入衰亡期.

2.4 環(huán)境對f-3菌株反硝化性能的影響

2.4.1 碳源種類對f-3反硝化性能影響

碳源在很大程度上影響著硝酸鹽還原酶的活性[10-11].如圖3所示，4種碳源中，f-3菌株0～12 h的反硝化能力差別不大，但28 h后反硝化能力有明顯差異，其中以琥珀酸鈉為唯一碳源時，f-3菌株的好氧反硝化能力最強(qiáng)，培養(yǎng)28 h后，對NO3-N和NO2-N的去除率分別達(dá)到91%和50%.這與王世梅等[9]研究結(jié)果相似，所以實驗均采用琥珀酸鈉作為碳源.

2.4.2 碳氮比對f-3菌株反硝化性能影響

本研究以琥珀酸鈉為碳源，分別在反硝化培養(yǎng)基中添加不同量的碳源，將C/N值控制在1∶20～1∶1，考察f-3菌株反硝化性能（見圖3）.如圖4所示，不同C/N下，f-3菌株的好氧反硝化能力有一定區(qū)別，以NO3-為氮源時，最佳C/N為8∶1，28 h的去除率達(dá)89%，以NO2-為氮源時，最佳C/N為16∶1，36 h的去除率為55%，C/N為12∶1和20∶1時，36 h的去除率也均超過50%.C /N 較低時，可能是因為碳源不足，影響反硝化菌的生長，從而導(dǎo)致反硝化能力較低.達(dá)到最適C /N后，繼續(xù)增加C /N，產(chǎn)生的多余中間產(chǎn)物可能會抑制好氧反硝化進(jìn)程[12].

2.4.3 投菌量對f-3菌株反硝化性能影響

接種量是影響菌株好氧反硝化功能的重要因素，適當(dāng)?shù)慕臃N量能有效地提高菌株的反硝化能力.但接種量對f-3菌株反硝化性能影響較小，以NO3-為氮源時，0～28 h內(nèi)，投菌量越高，反硝化能力越強(qiáng)，28 h后，不同投菌量下，f-3菌株的反硝化能力趨于相同.這可能是因為接種量對菌株反硝化能力的影響可能和細(xì)菌數(shù)量有關(guān)，在生長穩(wěn)定期，不同接種量的細(xì)菌數(shù)量類似，其反硝化能力也趨于一致.

2.4.4 溫度對f-3菌株反硝化性能影響

如圖6所示，以NO3-為唯一氮源時，溫度對f-3菌株的反硝化能力有一定影響，其中10 oC時的反硝化能力明顯低于其他溫度，而在30 oC～40 oC范圍內(nèi)，f-3菌株的反硝能力差別不大，在36 h時，對NO3-的去除率最高，均達(dá)90%.而以NO2-為唯一氮源時，10 oC～40 oC對f-3菌株降解NO[-2]能力無明顯影響.表明，如實現(xiàn)實際應(yīng)用，低溫環(huán)境下f-3菌株對NO2-的去除有很大應(yīng)用優(yōu)勢.

2.4.5 pH對f-3菌株反硝化性能影響

如圖7所示，pH對f-3菌株反硝化性能有較大影響.以NO3-為唯一氮源，pH為6時，f-3菌株的反硝化能力最強(qiáng)，28 h對NO3-去除率達(dá)93%.以NO2-為唯一氮源，pH為4時，f-3菌株的反硝化能力最強(qiáng)，36 h對NO3-去除率達(dá)59%.據(jù)報道，好氧反硝化菌P. stutzeri BMEN1，更適于在偏堿性條件（pH>7）生長和好氧反硝化的實現(xiàn)[13]，本研究中的f-3菌株在酸性條件下反硝化能力更強(qiáng)，其反硝化機(jī)制值得進(jìn)一步探討.

2.5 苯酚和喹啉對f-3菌株反硝化性能影響

苯酚和喹啉是焦化廢水中含量最多的兩種有毒有機(jī)成分，可對微生物產(chǎn)生毒害.如將f-3菌株應(yīng)用于焦化廢水或其他類似水質(zhì)廢水的脫氮，需要考慮苯酚和喹啉對其反硝化功能的影響.如圖8和圖9所示，100～400 mg/L的苯酚或喹啉均對f-3菌株的反硝化性能產(chǎn)生抑制作用，且苯酚或喹啉濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，且以NO2-為唯一氮源時，f-3菌株反硝化能力受抑制程度高于以NO3-為唯一氮源時的情況.但在400 mg/L的苯酚或喹啉下，f-3菌株仍保留一定反硝化能力，特別是以NO3-為唯一氮源時，對NO3-的去除率分別為50%和46%.表明f-3菌株在焦化廢水類似含苯酚或喹啉廢水的脫氮處理中有較大應(yīng)用潛力.

3 結(jié)論

1）從焦化廢水活性污泥中篩選的f-3菌株具有好氧反硝化功能，經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定，該菌株屬于P. pseudoalcaligenes.

2）f-3菌株去除NO3-的最適條件是以琥珀酸鈉為唯一碳源在30 oC～40 oC范圍內(nèi)，pH為6，最佳C/N為8∶1.去除NO2-的最適條件是以琥珀酸鈉為唯一碳源在10 oC～40 oC范圍內(nèi)，pH為4時，最佳C/N為16∶1.

3）f-3菌株對喹啉和苯酚有一定耐性，在100～400 mg/L的喹啉和苯酚環(huán)境下，仍具有一定的反硝化能力.

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Screening and characterization of an aerobic denitrifying bacterium

from the coking wastewater treatment

ZHANG Zheng1， 2， HUANG Jiafu1， 2， QIN Huajing1， 2， HUANG Xuerong1， 2， DENG Dongmei*1

（1. School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006，China； 2. Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources （Guangxi University of Science and Technology），Liuzhou 545006， China）

Abstract： In order to improve the efficiency of denitrification of coking wastewater， an aerobic denitrifying bacterial strain f-3 was screened from aerobiotic sludge sewage in coking wastewater treatment system of Liuzhou Iron and Steel Group Company Ltd. According to the morphological， physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis， the strain f-3 was identified as Pseudomonas sp. The influence of the initial pH， temperature， C/N， investment and the amount of bacteria， different carbon sources on the denitrification ability of this strain was then investigated. The best reaction conditions were further optimized by response surface methods. Results showed that at 35 ℃， potassium nitrate as the sole nitrogen source， NO3- initial concentration of 180 mg/L， carbon and nitrogen ratio of 10∶1， initial pH 6.0， inoculum concentration of 2%， the denitrification ability of the strain performance was best and the removal rate of NO3- reached 92.85% after 36 h. When sodium nitrite as the sole nitrogen source， the strain showed best denitrification ability， at 280 mg/L NO2-， pH 4.0， C/N 15∶1， 35 ℃ and the degradation rate reached 68.45% after 36 h. Moreover， f-3 could preserve the ability of aerobic denitrifying to a certain extent even at 400 mg/L phenol or 400 mg/L quinoline.

Key words： coking wastewater； aerobic denitrification； bacterial strain； functional screening

（學(xué)科編輯：黎 婭）