建立自發(fā)緩解2型糖尿病動(dòng)物模型可行性探討

高日麗　林可意　譚鶯　劉子瑜　許海霞

【摘要】 目的 探討建立2型糖尿病自然病程中高血糖自發(fā)緩解現(xiàn)象動(dòng)物模型的可行性。方法 將8只C57BL/6J品系雄性小鼠（體質(zhì)量21 g）隨機(jī)分為高脂飲食組（4只）和對(duì)照飲食組（4只），分別予高脂飼料（20%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)、60%脂肪）和匹配對(duì)照飼料（70%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)、10%脂肪）喂養(yǎng)。每周監(jiān)測(cè)2組體質(zhì)量、血糖、攝食量，為期12個(gè)月。高脂飲食誘導(dǎo)高血糖出現(xiàn)及自發(fā)緩解時(shí)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)、胰島素耐量實(shí)驗(yàn)。觀察終點(diǎn)檢測(cè)2組小鼠血清胰島素、血脂、腎臟功能及評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞質(zhì)量。結(jié)果 高脂飲食組空腹血糖呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，第3個(gè)月開(kāi)始出現(xiàn)空腹高血糖，與對(duì)照飲食組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

【關(guān)鍵詞】 高脂飲食；2型糖尿??；胰島；血糖

【Abstract】 Objective To investigate the feasibility of establishing an animal model of type 2 diabetes mellitus with spontaneous remission. Methods Eight male C57BL/6J mice （body weight=21 g） were randomly divided into high-fat diet（n=4）and control groups（n=4）. In the high-fat diet group， high-fat diet including 20% carbohydrate， 20% protein and 60% fat was delivered. In the control group， the diet consisting of 70% carbohydrate， 20% protein and 10% fat was fed. The body weight， blood glucose level and feed intake between two groups were monitored weekly for 12 months. The incidence of hyperglycemia was induced by high-fat diet. Upon spontaneous remission， glucose and insulin tolerance tests were performed. At the end of the experiment， serum levels of insulin and lipid， renal function and the quality of islet βcells were evaluated between two groups. Results In the high-fat diet group， dynamic changes were detected in the fasting blood glucose level. The fasting hyperglycemia began to occur in the 3rd month， significantly differed from that in the control group （P0.05） until the end of the observation. The phenotype of hyperglycemia with spontaneous remission was accompanied with persistent increase in body weight， progression of insulin resistance， enlargement of the average islet area and significant elevation of serum insulin level. Conclusion The C57BL/6J mouse models of type 2 diabetes mellitus with spontaneous remission can be established by fed with high-fat diet for 12 months.

【Key words】 High-fat diet； Type 2 diabetes mellitus； Islet； Blood glucose

2型糖尿病（T2DM）是一種代謝綜合征，其已成為嚴(yán)重危害公共健康的慢性疾病[1]。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2015年全球20～79歲的人群中約有4.15億糖尿病患者，全球大約每6 s即有1例糖尿病患者死亡，中國(guó)90%的糖尿病患者為T2DM[2-3]。目前認(rèn)為T2DM的主要發(fā)病機(jī)制是胰島素抵抗和（或）胰島素分泌功能障礙，診斷時(shí)殘存胰島β細(xì)胞約為40% ～60%，診斷后胰島β細(xì)胞功能呈進(jìn)行性衰退[4]。另一方面，也有研究顯示疾病自發(fā)緩解的現(xiàn)象，診斷后未接受降糖藥物治療的122 781例T2DM患者，研究者對(duì)其隨訪7年，病程小于2年的患者疾病自發(fā)緩解率為4.6%，且疾病緩解與短病程、基線時(shí)GHbA1c僅輕度升高、未進(jìn)行降糖藥物干預(yù)相關(guān)[5]。

為了進(jìn)一步觀察T2DM的自然病程及相關(guān)機(jī)制，需要建立T2DM自發(fā)誘導(dǎo)緩解的動(dòng)物模型。超體質(zhì)量、肥胖與T2DM的發(fā)生相關(guān)。在以高熱量膳食干預(yù)方法建立的肥胖小鼠模型上可觀察到胰島素抵抗、高胰島素血癥、輕度高血糖、高血脂等類似于早期T2DM臨床特征的表型，因而該模型被廣泛應(yīng)用于T2DM的基礎(chǔ)研究[6]。既往研究者們常采用12～20周高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠至其隨機(jī)血糖穩(wěn)定達(dá)11.1 mmol/L為造模成功。此時(shí)，研究者可開(kāi)始實(shí)施不同的干預(yù)措施觀察疾病進(jìn)展或逆轉(zhuǎn)。我們對(duì)C57BL/6J小鼠采用單純高脂飲食喂養(yǎng)12個(gè)月，觀察其空腹血糖的動(dòng)態(tài)變化，以期了解建立自發(fā)性緩解的T2DM動(dòng)物模型的可行性。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8只6周齡健康C57BL/6J品系雄性小鼠（體質(zhì)量21 g）購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。所有小鼠飼養(yǎng)于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房中，室溫（20±2）℃，相對(duì)濕度40% ～70%，每日12 h光照，晝夜循環(huán)，自由飲食飲水。

二、材料及儀器

飼料購(gòu)于美國(guó)Research Diets公司，血糖檢測(cè)使用雅培Optium試紙，血清總膽固醇、甘油三酯、LDL-C、HDL-C、尿素和肌酐采用酶法測(cè)定（全自動(dòng)生化分析儀）。胰島素水平檢測(cè)采用超敏酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒（Mercodia），胰腺組織胰島素（Cell Signalling）染色使用免疫組織化學(xué)（免疫組化）檢測(cè)法。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

8只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，根據(jù)體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為高脂飲食組（4只）和對(duì)照飲食組（4只），分別予高脂飼料（20%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)、60%脂肪）和匹配對(duì)照飼料（70%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)、10%脂肪）喂養(yǎng)。每周記錄小鼠攝食量、稱量體質(zhì)量并于尾靜脈取血測(cè)空腹血糖（禁食6 h）。分別在高脂飲食誘導(dǎo)出空腹高血糖并持續(xù)3個(gè)月、空腹高血糖自發(fā)緩解并持續(xù)3個(gè)月時(shí)予所有小鼠行OGTT和胰島素耐量試驗(yàn)（IPITT）。高血糖自發(fā)緩解指與對(duì)照飲食組相比空腹血糖值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。繼續(xù)監(jiān)測(cè)小鼠的攝食量、體質(zhì)量和空腹血糖，總觀察期12個(gè)月。觀察終點(diǎn)處死小鼠，取全血分離血清于-80℃凍存，檢測(cè)空腹血糖、胰島素HOMA指數(shù)及總膽固醇等，取胰腺組織稱量質(zhì)量后用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋常溫保存。

2.OGTT

小鼠禁食15 h，稱量體質(zhì)量并測(cè)定空腹血糖，取 20%葡萄糖溶液以2 g/kg的劑量灌胃后開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別檢測(cè)30、60、90、120 min小鼠尾靜脈微量血糖水平。

3.IPITT

小鼠禁食6 h后，稱量體質(zhì)量并測(cè)定空腹血糖，腹腔注射胰島素溶液（諾和銳，丹麥諾和諾德公司），劑量為0.8 U/kg，檢測(cè)注射后30、60、90 min小鼠尾靜脈微量血糖水平。

4.胰島素水平檢測(cè)

參照小鼠超敏胰島素定量檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）說(shuō)明書，往包被微孔（板）中分別加入校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本，將制備好的酶結(jié)合物1×溶液加入以上各孔進(jìn)行孵育，與3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色反應(yīng)后加入硫酸終止反應(yīng)，最后通過(guò)酶標(biāo)儀在450 nm處讀取反應(yīng)的終點(diǎn)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣本血清胰島素濃度。

5.胰腺組織胰島素與4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）免疫熒光染色

分離胰腺后迅速稱量質(zhì)量，用4%多聚甲醛固定胰腺，石蠟包埋后切片（5 μm）。用豚鼠抗胰島素一抗（1∶ 200稀釋，英國(guó)Abcam公司）4℃過(guò)夜孵育，然后用帶有Rhodamine熒光基團(tuán)的驢抗豚鼠二抗（1∶ 200，美國(guó)Jackson Immuno Research公司）室溫孵育2 h，再用DAPI（美國(guó)Invitrogen公司）染核。使用Axio Imager Z1正置熒光顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss公司）攝片。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Graph Pad Prism軟件作圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組內(nèi)前后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比則先用單組重復(fù)測(cè)量資料方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)再用配對(duì)t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、空腹血糖在高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠中的動(dòng)態(tài)變化

基線時(shí)，2組小鼠空腹血糖水平無(wú)差異[高脂飲食組為（7.86±0.74）mmol/L，對(duì)照飲食組為（8.43±0.64）mmol/L，P=0.30]。飲食干預(yù)開(kāi)始后，2組小鼠空腹血糖均呈逐漸上升趨勢(shì)，高脂飲食組上升更顯著。觀察第3個(gè)月，高脂飲食組血糖達(dá)（11.73±0.80）mmol/L，較對(duì)照飲食組（9.85±0.44）mmol/L高（P=0.006）。這一具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的血糖分離趨勢(shì)持續(xù)至第7個(gè)月[高脂飲食組（11.34±1.45）mmol/L，對(duì)照飲食組（8.46±0.80）mmol/L，P=0.013]。第8個(gè)月高脂飲食組血糖水平下降至（10.03±1.73）mmol/L，而對(duì)照飲食組仍維持在8.50 mmol/L左右。此后，高脂飲食組血糖繼續(xù)逐漸下降，至第12個(gè)月為（8.26±1.47）mmol/L，對(duì)照飲食組為（7.54±0.14）mmol/L（P=0.91），見(jiàn)圖1A。

與空腹血糖的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)不同，觀察期內(nèi)小鼠體質(zhì)量呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，分為前5個(gè)月的快速增長(zhǎng)期和后7個(gè)月的緩慢增長(zhǎng)/平臺(tái)期?；€時(shí)，2組小鼠的體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[高脂飲食組（24.99±0.76）g，對(duì)照飲食組（25.03±0.84）g，P=0.96]；前5個(gè)月中，高脂飲食組小鼠平均體質(zhì)量增長(zhǎng)速度為每個(gè)月（5.78±0.64）g，對(duì)照飲食組小鼠為每個(gè)月（2.50±0.35）g（P<0.001）。期間，在第2個(gè)月末2組小鼠體質(zhì)量比較差異已具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[高脂飲食組（36.84±3.44）g，對(duì)照飲食組（30.96±1.88）g，P=0.024]。隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，2組體質(zhì)量分離的趨勢(shì)加劇。至觀察終點(diǎn)，高脂飲食組體質(zhì)量為（59.90±2.79）g，較對(duì)照飲食組的（39.66±5.33）g高（P=0.004），見(jiàn)圖1B。

與體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)不同，2組小鼠的月均攝入熱量在第1個(gè)月最高，此后逐漸下降，自第4個(gè)月始穩(wěn)定小幅波動(dòng)直至觀察終點(diǎn)。組間比較結(jié)果顯示，1～8個(gè)月2組攝入熱量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），9～10個(gè)月，對(duì)照飲食組攝入熱卡略高于高脂飲食組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05），見(jiàn)圖1C。

A：12個(gè)月觀察期內(nèi)小鼠月均血糖；B： 12個(gè)月觀察期內(nèi)小鼠月均體質(zhì)量；C： 12個(gè)月觀察期內(nèi)小鼠月均攝食量；與對(duì)照飲食組比較，*為P<0.05，#為P<0.01

二、空腹高血糖自發(fā)緩解前后糖耐量、胰島素耐量的比較

觀察期第6個(gè)月（高脂飲食誘導(dǎo)出空腹高血糖并持續(xù)3個(gè)月）高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠OGTT曲線下面積、IPITT曲線下面積均較對(duì)照飲食組大，且OGTT曲線下面積2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2A、B。觀察期第11個(gè)月為高脂飲食組空腹高血糖自發(fā)緩解并持續(xù)3個(gè)月，此時(shí)OGTT結(jié)果示高脂飲食組空腹血糖較對(duì)照飲食組高，但兩者均在正常血糖范圍內(nèi)，分別為（6.07±0.56）mmol/L與（4.88±0.62）mmol/L（P=0.046），其他時(shí)間點(diǎn)2組小鼠血糖絕對(duì)值、曲線下總面積比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），見(jiàn)圖2C。

IPITT結(jié)果顯示，對(duì)照飲食組小鼠血糖在注射胰島素后30 min血糖自基線時(shí)的（8.00±1.04）mmol/L降至（5.17±1.67）mmol/L，60 min時(shí)進(jìn)一步降至谷值（4.33±1.72）mmol/L，之后略回升；而高脂飲食組小鼠血糖曲線平緩，無(wú)顯著降幅；2組在注射胰島素后各時(shí)間點(diǎn)血糖下降百分比絕對(duì)值及血糖下降百分比曲線下面積變化趨勢(shì)與觀察期第6個(gè)月時(shí)IPITT相似，見(jiàn)圖2D。

進(jìn)一步比較前后2次OGTT在組內(nèi)的差異，結(jié)果提示對(duì)照飲食組各時(shí)間點(diǎn)血糖水平及OGTT曲線下面積前后比較無(wú)差異。高脂飲食組第11個(gè)月OGTT曲線下面積與第6個(gè)月比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但經(jīng)單組重復(fù)測(cè)量資料方差分析，第11個(gè)月時(shí)糖負(fù)荷后各時(shí)間點(diǎn)血糖水平與第6個(gè)月時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.95，P

三、空腹高血糖自發(fā)緩解伴隨胰島功能代償

空腹高血糖自發(fā)緩解現(xiàn)象維持至觀察終點(diǎn)。觀察終點(diǎn)處死小鼠時(shí)，2組各有1只小鼠因心臟穿刺采血失敗未能獲得足夠量血清，不納入血清指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析。比較2組小鼠空腹血清胰島素水平，高脂飲食組較對(duì)照飲食組高（P=0.007），見(jiàn)表1。

胰腺組織切片胰島素染色顯示高脂飲食組胰島總數(shù)、長(zhǎng)徑超過(guò)150 μm或面積大于3 000 μm2的大胰島比例較對(duì)照飲食組的多（分別為40.91%、43.18%；5.88%、5.88%），平均胰島面積較對(duì)照飲食組大（P=0.009，圖3A～D），提示胰島β細(xì)胞合成及分泌胰島素作用增強(qiáng)。

A：胰腺組織胰島素（Ins紅色）與DAPI（藍(lán)色）免疫熒光染色（×200）；B：?jiǎn)蝹€(gè)胰島長(zhǎng)短徑大小分布（×400，n=3）；C：?jiǎn)蝹€(gè)胰島面積分布（×400，n=3）；D：平均胰島面積；與對(duì)照飲食組比較，#為P<0.01

進(jìn)一步計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和胰島素分泌指數(shù)（HOMA-β），HOMA-IR結(jié)果示高脂飲食組約為對(duì)照飲食組的4倍（表1），與觀察期第11個(gè)月IPITT結(jié)果一致，即高脂飲食顯著增加胰島素抵抗水平；而高脂飲食組的HOMA-β也較對(duì)照飲食組高，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步行功效檢驗(yàn)，效能為0.09，因此該指標(biāo)陰性結(jié)果可能與本研究樣本量較小有關(guān)。高脂飲食組小鼠LDL-C較對(duì)照飲食組高（P<0.001）。2組血清肌酐、尿素氮比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），見(jiàn)表2。

討 論

在本研究中，筆者觀察到持續(xù)單純高脂飲食誘導(dǎo)空腹高血糖繼之自發(fā)緩解并伴隨糖耐量改善。這是據(jù)筆者所知首次觀察到的T2DM自發(fā)性緩解的動(dòng)物模型。此模型具有以下特征，首先，糖代謝異常的自發(fā)緩解為完全代償，不僅表現(xiàn)為空腹高血糖回落，糖負(fù)荷后血糖水平亦恢復(fù)至對(duì)照小鼠水平。此模型中高血糖幅度較低，更為常用的T2DM動(dòng)物模型是高脂聯(lián)合高糖飲食干預(yù)8～12周，或高脂聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素注射以達(dá)到更高的空腹血糖水平（15～20 mmol/L），這可能是既往未能在T2DM動(dòng)物模型中觀察到空腹高血糖自發(fā)緩解現(xiàn)象的原因。其次，上述代償?shù)闹饕獧C(jī)制是胰島β細(xì)胞功能上調(diào)，表現(xiàn)為胰島數(shù)目及平均面積增加、血清胰島素水平顯著升高。在這一過(guò)程中，胰島素抵抗的程度無(wú)明顯改善，主要表現(xiàn)在高脂飲食誘導(dǎo)體質(zhì)量持續(xù)增加，即使在空腹高血糖完全自發(fā)緩解后，小鼠體質(zhì)量仍繼續(xù)緩慢上升；IPITT數(shù)據(jù)也提示較空腹高血糖出現(xiàn)時(shí)，空腹高血糖緩解時(shí)胰島素敏感性更低。需要指出的是，2次OGTT中，對(duì)照飲食小鼠糖負(fù)荷后60 min血糖水平亦略高于11.1 mmol/L，達(dá)到糖代謝異常的診斷標(biāo)準(zhǔn)。這一現(xiàn)象與C57BL/6J小鼠本身因?yàn)檎{(diào)控線粒體質(zhì)子泵的煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶（Nnt）突變導(dǎo)致胰島β細(xì)胞受葡萄糖刺激后胰島素釋放障礙有關(guān)。即C57BL/6J小鼠本身具有輕度糖耐量異常的遺傳特性[7]。最后，本模型中空腹高血糖程度較輕，單次最高空腹血糖未大于14 mmol/L，與在T2DM自發(fā)緩解的患者中觀察到的基線高血糖程度較輕的現(xiàn)象一致[5]。綜上所述，本模型特征是顯著肥胖并輕度高血糖，在至少8個(gè)月的高脂飲食干預(yù)中觀察到的胰島β細(xì)胞功能失代償繼之再被完全代償?shù)闹饕獧C(jī)制是高脂飲食誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞功能上調(diào)。

由于單純高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型被廣泛應(yīng)用，迄今為止已有較多相關(guān)研究。目前認(rèn)為高脂飲食能誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞增殖、肥大及凋亡[8]。雄性C57BL/6J 小鼠中行短程高脂飲食干預(yù)可觀察到胰島β細(xì)胞質(zhì)量增加伴隨早期胰島β細(xì)胞Ki-67表達(dá)上調(diào)[9]。其他研究者使用高脂飲食干預(yù)4～7 d后即觀察到胰島β細(xì)胞Cyclin D2表達(dá)上調(diào)[10]。這些均提示高脂飲食對(duì)調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。上述研究觀察時(shí)間相對(duì)較短，為高脂飲食的急性作用，小鼠空腹血糖未達(dá)11.1 mmol/L。有研究者在雌性小鼠中進(jìn)行12個(gè)月的長(zhǎng)程高脂飲食干預(yù)并誘導(dǎo)出肥胖表型，同樣觀察到胰島質(zhì)量的增加[11]。但迄今為止，上述肥胖表型與本研究中的空腹高血糖自發(fā)緩解表型存在差異，進(jìn)一步在本模型上觀察胰島β細(xì)胞功能的動(dòng)態(tài)變化及調(diào)控機(jī)制是探討T2DM自發(fā)緩解機(jī)制的直接途徑。

本研究的局限性包括：為單純的描述性研究，對(duì)小鼠空腹高血糖自發(fā)性緩解未行進(jìn)一步機(jī)制探討，且2組小鼠數(shù)目均較少；另外，本模型中血糖僅出現(xiàn)輕度升高，所觀察到的自發(fā)緩解現(xiàn)象是否適用于血糖更高的模型如高糖高脂誘導(dǎo)的T2DM動(dòng)物模型等，尚需進(jìn)一步證實(shí)。在此模型上擴(kuò)大樣本量，檢測(cè)胰島β細(xì)胞的增殖、肥大、凋亡、去分化等病理生理過(guò)程的變化，并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)的胰島β細(xì)胞功能完全代償相關(guān)機(jī)制研究將是筆者進(jìn)一步的研究方向。

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（收稿日期：2018-01-30）

（本文編輯：洪悅民）