紫外分光光度法測定黑曲霉發(fā)酵液中糠醛的含量

邱勇 趙姍 黃婕 代園鳳 楊莉琴 陳雪 黃杰 李祝

摘要：本文建立了一種利用紫外分光光度法測定黑曲霉（Aspergillusniger）發(fā)酵液中糠醛含量的方法。首先對糠醛標準溶液全波長掃描，確定糠醛最大吸收波長，并作為糠醛含量的測定波長。測量糠醛工作液吸光度，繪制糠醛濃度與吸光度關(guān)系的標準曲線。制備黑曲霉發(fā)酵液，用50%乙醇將發(fā)酵母液稀釋10倍，測定波長下測定吸光度，參照標準曲線計算發(fā)酵液中糠醛的含量。結(jié)果表明糠醛的最大吸收波長為276nm，即為測定波長;糠醛標準曲線線性回歸方程：y=0.164x+0.001，R2=0.999，測定范圍內(nèi)線性良好;發(fā)酵液糠醛含量30.0244 μg/ml;精密度RSD值為0.315%，儀器精密度良好;穩(wěn)定性RSD值0.450%，待測樣品在120 min內(nèi)穩(wěn)定;重現(xiàn)性RSD值0.828%，試驗方法具有良好重現(xiàn)性;回收率為99.12%～100.35%，其RSD值0.617%。本方法操作易掌握、測定快速、穩(wěn)定性好且儀器設備成本較低，有利于基礎研究和推廣。為今后研究黑曲霉其他次生代謝物含量提供了一定方法和數(shù)據(jù)的參考。

關(guān)鍵詞：黑曲霉;糠醛;紫外分光光度法

Determination of Furfural in Aspergillusniger Fermentation Broth by UltravioletSpectrophotometry

QIU Yong1，2，ZHAO Shan1，HUANG Jie1，DAI Yuan?feng2，YANG Li?qin1，CHEN Xue2，HUANG Jie1，LI Zhu1，2*

（1.College of Life Sciences， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China;2.Bijie Subsidiary in Guizhou Tobacco Company， Bijie， Guizhou 551700， China）

Abstract：A method for determination of furfural content in the fermentation broth of Aspergillusniger van Tieghem （Fungi： Eurotiales：Trichocomaceae）was developed by ultraviolet （UV） spectrophotometry. The maximum absorption wavelength of furfural was first determined by the full-wavelength scan of furfural standard solution， and then used as measurement wavelength of furfural content. The absorbance of furfural working broth was measured and the standard curve of the relationship between furfural concentration and absorbance was drawn. The fermentation broth of Aspergillusniger was prepared. The mother broth of fermentation was diluted 10 times with 50% ethanol. The absorbance was determined at the measurement wavelength. The furfural content in the fermentation broth was calculated with reference to the standard curve. The results show that the maximum absorption wavelength of furfural is 276nm， which is the measurement wavelength. The linear regression equation of furfural standard curve is： y = 0.164x + 0.001， R squared = 0.999， and the linearity within the measurement rangeis good. The content of furfural in fermentation broth is 0.0244 g/ml. The precision RSD value is 0.315%， and the precision of the instrument is good. The stability RSD value was 0.450%， and the samples under test were stable within 120 min. Reproducibility RSD was 0.828%， and the test method had good reproducibility. The recovery rate is 99.12%-100.35%， and its RSD value is 0.617%. This method is easy to grasp， fast in measurement， good in stability and low in cost of equipment， which is conducive to basic research and promotion. It provides a reference for some methods and data for the further study on the content of other secondary metabolites of Aspergillusniger.

Key words：Aspergillusniger;furfural;ultraviolet spectrophotometry

糠醛（furfural）又稱呋喃甲醛或麩醛[1]，主要是由戊聚糖分解或酵母發(fā)酵所產(chǎn)生，具有一定的毒性[2]，是一種重要的雜環(huán)類有機化合物[3]?？啡┛勺鳛樯a(chǎn)衍生物（如呋喃、甲基呋喃、四氫呋喃、呋喃酸、糠醇等）的起始原料[4];作為萃取劑用于潤滑油、柴油和植物油的精制[5];作為殺蟲劑[6]等。隨著世界范圍內(nèi)能源危機和環(huán)境問題的日益嚴峻，各化工領(lǐng)域?qū)啡┑男枨罅繉掷m(xù)增長[7]，糠醛應用前景廣闊。

黑曲霉在分類學上屬于曲霉菌屬半知菌亞門，是發(fā)酵工業(yè)上的重要菌種[8]。黑曲霉可生產(chǎn)功能性酶（酸性蛋白酶、纖維素酶等）、活性物質(zhì)（檸檬酸、甲殼素）;在飼料生產(chǎn)、環(huán)保和醫(yī)藥[9]也應用廣泛。目前無黑曲霉獨立產(chǎn)糠醛的相關(guān)報道，利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)糠醛豐富了糠醛制備渠道。

糠醛的測定方法主要有化學法[10-11]、HPLC[12-13] 、紫外分光光度法[14-16]?；瘜W法的干擾嚴重，被測組分要求純度較高，精確度較低;HPLC法樣本處理及測定過程繁瑣復雜且成本較高，不適用于長期而頻繁的測定;紫外分光光度法具有操作易掌握、測定快速，且酒體中共存組份對紫外吸收光譜測定不產(chǎn)生干擾。本實驗采用紫外分光光度法測定黑曲霉發(fā)酵液中糠醛的含量，為今后研究黑曲霉其他次生代謝物含量提供了一定方法和數(shù)據(jù)的參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

黑曲霉（Aspergillusniger）xj：中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存，CCTCC No：M206021。

1.1.2試劑

糠醛（≥99.9%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司;葡萄糖（分析純）：天津市優(yōu)譜化學試劑有限公司。

1.1.3儀器與設備

BIOMATE 3S紫外分光光度計：賽默飛世爾科技有限公司;UV-8000紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司;華普達THZ-82恒溫振蕩器：常州華普達有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1孢子懸液的制備

活化黑曲霉菌株，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體斜面培養(yǎng)基上，于26℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5天。制備0.1%（V/V）吐溫-80孢子懸浮液。參照袁洪威等人[17]用分光光度法測定黑曲霉孢子濃度的方法。計算得孢子懸浮液孢子量：6.67×106 個/mL。

1.2.2糠醛全波長掃描與標準曲線繪制

糠醛全波長掃描：精密吸取25 μl糠醛（99.9%）標準品，用50%乙醇定容，得到濃度為575 μg/mL糠醛貯備液。轉(zhuǎn)移1 mL貯備液用 50%乙醇定容，得到濃度為11.5 μg/mL糠醛標準溶液。分別取標準溶液3、4、5、6、7 mL糠醛標準溶液至10 mL容量瓶，50%乙醇定容，用50%乙醇作為空白對照，在紫外分光光度計上進行糠醛全波長掃描。

標準曲線繪制：精密吸取 11.5 μg/mL的糠醛標準溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，用50%乙醇定容，搖勻，得到濃度依次為1.15、2.30、3.45、4.60、5.75 μg/mL的待測液。以 50%乙醇為空白對照，在 276 nm 處測定吸光度。

1.2.3黑曲霉發(fā)酵液中糠醛含量測定

吸取0.5 mL孢子數(shù)量為6.67×109孢子懸液接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5天，條件為150 r/min、26℃。過濾分離得到發(fā)酵母液，加入等量無水乙醇，靜置5 min，10000 r/min離心10 min沉淀絮狀變性蛋白，吸取上清液，再次加入50%乙醇，得到原發(fā)酵液稀釋10倍的樣品。連續(xù)制定5份發(fā)酵液樣品，在波長276 nm處測定吸光度，得到結(jié)果參照標準曲線計算發(fā)酵液中糠醛的含量。

1.2.4精密度試驗

制備同一發(fā)酵液樣品5份，測定波長下連續(xù)測定5次，計算吸光度相對標準偏差。

1.2.5穩(wěn)定性試驗

分別于0、30、60、90、120 min測定發(fā)酵液樣品的吸光度，分析穩(wěn)定性。

1.2.6重復性試驗

平行處理同一批發(fā)酵液，制備5份發(fā)酵液樣品，分析重復性。

1.2.7回收率試驗

向糠醛標準品稀釋液中添加三個濃度水平的發(fā)酵液（各濃度平行3次），制備9份待測樣品溶液，測定吸光度，計算回收率。

2結(jié)果與分析

2.1糠醛最大吸收波長的確定

糠醛梯度掃描結(jié)果表明，糠醛在276 nm處有最大吸收峰，無雜峰，因此276 nm作為糠醛的測定波長，如圖1所示。

2.2糠醛標準曲線的繪制

經(jīng)測量得到吸光度與所對應溶液濃度如表1。以糠醛濃度（x，μg/mL）為橫坐標，溶液吸光度（y）為縱坐標作圖，得到糠醛的標準曲線，結(jié)果如圖2。對數(shù)據(jù)進行線性回歸分析得到回歸方程：y=0.164x+0.001（R2= 0.999），濃度在1～6 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，滿足測試要求。

2.3黑曲霉發(fā)酵液中糠醛含量測定

根據(jù)測定結(jié)果，參照標準曲線計算出稀釋糠醛含量和發(fā)酵液糠醛含量，如表2。發(fā)酵液糠醛平均含量為30.0244 μg/mL。

2.4精密度試驗

吸光度與所對應發(fā)酵液中糠醛濃度（表3）。經(jīng)統(tǒng)計分析得到吸光度的RSD（相對標準偏差）值為0.315%，此結(jié)果表明測量儀器精密度高。

2.5穩(wěn)定性試驗

不同時間樣品吸光度與發(fā)酵液中糠醛濃度（表4）。吸光度的RSD值為0.450%，說明待測樣品在120min內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.6重現(xiàn)性試驗

平行處理同一批發(fā)酵液，制備5份發(fā)酵液樣品，測定糠醛含量（表5）。吸光度的RSD值為0.828%，表明實驗結(jié)果和方法的重現(xiàn)性較高。

2.7加樣回收率

濃度為1.15 μg/mL的糠醛標準品稀釋液與三個濃度水平為1.841 μg/mL、2.549 μg/mL、3.579 μg/mL發(fā)酵液混合。測定吸光度，并計算每個水平的RSD值（結(jié)果見表6）。試驗樣品的回收率均在99.12%～100.35%之間，RSD值為0.617%，表明該樣品的回收率較高。

3結(jié)論與討論

本文建立了一種利用紫外分光光度法測定黑曲霉發(fā)酵液中糠醛含量的方法?？啡藴嗜芤鹤魅ㄩL掃描，確定糠醛最大吸收波長是276 nm。梯度稀釋糠醛標準溶液，測定吸光度，分析得到線性回歸方程：y = 0.164x + 0.001，R2= 0.999，測定范圍內(nèi)線性良好。該方法測定黑曲霉發(fā)酵液中糠醛平均濃度為30.0244 μg/mL，回收率為99.12%～100.35%，回收率較高，儀器精密度良好，RSD值為0.315%。張素[18]等人建立了檢測黑曲霉菌絲體中糠醛含量的分析方法，得到黑曲霉菌絲體中糠醛含量為1.872 mg/kg。本實驗結(jié)果表明黑曲霉發(fā)酵液中糠醛含量比菌絲體中要高。在一定程度上提高糠醛的獲得率。本方法操作易掌握、測定快速、穩(wěn)定性好、儀器設備成本較低，為今后研究黑曲霉其他次生代謝物含量提供了一定方法和數(shù)據(jù)的參考。

參考文獻：

[1]王建剛，李麗.反相高效液相色譜法測定白酒中糠醛[J].理化檢驗（化學分冊），2010，46（12）：1470-1471.

[2]黃湘源，季明德 動力學分光光度法同時測定微量磷、砷 、硅[J].分析化學，1995，23（11） ：1277-1279.

[3]薄德臣，李憑力.糠醛生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展及展望[J].林產(chǎn)化學與工業(yè)，2013，33（6）：128-134.

[4]Fengel D， Wegener G .Wood ： Chemistry， Ultrastructure，Reactions[M].NY：Walter de Gruyter，1984：132.

[5]Abad S，Alonso J L，Santos V，et al.??Furfural from wood in catalyzed acetic acid media ： A mathematical assessment[J].Bioresource Technology，1997，62：115-122.

[6]Lichtenthaler，Cuny F W，Martin Dierk.Practical Routes from Blocks with Industrial Application Profiles[M].NY：VCH，1991：208.

[7]Dias A，Lima S，Pillinger M，et al.??Acidic cesium salts of 12-tungstophosphoric acid ascatalysts for the dehydration of xylose into furfural[J].Carbohydrate Research，2006，341（18）：2946-2953.

[8]邢來君，李明春，魏東盛.普通真菌學[M].北京：高等教育出版社，2010：391.

[9]劉金海.黑曲霉菌在生物發(fā)酵飼料上的應用及其產(chǎn)品對動物抗病力的影響[D].長春：吉林大學，2012.

[10]周碧青，張素平，張金彪.分光光度法和比色卡法快速測定蜂蜜中羥甲基糠醛[J].分析實驗室，2016，35（5）：586-589.

[11]劉俊峰，易平貴，金一粟.電位滴定法快速測定糠醛[J].湘潭礦業(yè)學院學報，1999，14（1）：50-53.

[12]趙貞，李翠枝，岳虹，等.HPLC法檢測乳品中5-羥甲基糠醛和糠醛[J].飲料工業(yè)，2015，18（1）：48-50.

[13]張根林，班麗麗，鄧輝，等.高效液相色譜法測定棉稈水解液中苯酚和糠醛[J].理化檢驗（化學分冊），2011，47（10）：1192-1194.

[14]黎瑞珍，董明洪，劉世忠.紫外分光光度法測定幾種白酒中的糠醛[J].瓊州大學學報，2005（5）：36-38.

[15]龍光明，裘璐，梁妍.紫外分光光度法測定6種市售酒中糠醛的含量[J].貴陽醫(yī)學院學報，2013，38（1）：61-63.

[16]張玉霞，石君輝，劉國慶，等.紫外分光光度法測定白酒中糠醛的含量[J].信陽師范學院學報（自然科學版），2002（1）：56-57.

[17]袁洪威，陳湖芳，李祝.等.分光光度法測定黑曲霉孢子濃度的研究[J].中國釀造，2017，36（4）：122-126.

[18]張素，肖洋，吉玉玉，等.高效液相色譜法測定黑曲霉xj菌絲體中糠醛的含量[J].中國釀造，2018，37（5）：181-183.