蠐螬質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升研究

尹志剛 胡昌亮 姚一鳴 王慧娟 彭禮軍 周英

摘要：蠐螬通常被用作中藥材，為了研究提高蠐螬質(zhì)量控制方法，采用薄層色譜的方法對(duì)蠐螬幾種氨基酸進(jìn)行定性鑒別，并且按照中國(guó)藥典相應(yīng)方法檢查蠐螬水分，灰分浸出物及重金屬含量。結(jié)果表明：薄層色譜斑點(diǎn)清晰，成點(diǎn)性好，建立了蠐螬氨基酸薄層色譜鑒別方法;水分含量7.00%～8.56%，總灰分范圍在29.79%～31.37%，酸不溶性灰分范圍為9.83%～12.53%，重金屬不得過(guò)30 ppm，蠐螬在50%醇熱浸出物不得少于40%。提升后的標(biāo)準(zhǔn)，有效控制了蠐螬的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：蠐螬;薄層鑒別;重金屬;浸出物;灰分

Research on the Improvement of Quality Standard for Grub of Holotrichia diomphalia （Coleoptera： Scarabaeidae）

YIN Zhi?gang1，2，3，HU Chang?liang1，2，3，YAO Yi?ming1，2，3，WANG Hui?juan2，3，PENG Li?jun2，3，ZHOU Ying2，3*

（1.?College of Pharmacy， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China; 2.?Guizhou Traditional Chinese Medicine and Ethnic Drug Engineering Center， Guiyang， Guizhou 550025， China; 3.?National & Local Joint Engineering Research Center for the Exploitation and Utilization Technology of Medicine and Food Dual?Use Resources in Southwest China， Guiyang， Guizhou 550025，China）

Abstract：The grub of Holotrichia diomphalia （Coleoptera： Scarabaeidae） are commonly used as part of the ingredients for traditional Chinese medicine.?The objective of this study is to improve the quality control method of Holotrichia diomphalia grub.?Thin?layer chromatography （TLC） method was used to qualitatively identify several amino acids.?The moisture， ash extract and heavy metal content of the grub were examined according to the corresponding method of the Chinese Pharmacopoeia.?Results indicated that thin?layer chromatogram spots were clear and well?pointed.?Thus， a thin?layer chromatography method was established for the identification of the amino acids.?The improved quality standard requires the moisture content to be 7.00% to 8.56%， the total ash extract ranging from 29.79% to 31.37%， the acid?insoluble ash ranging from 9.83% to 12.53 %， the heavy metals not exceeding 30 ppm， and the 50% alcohol hot leachate not less than 40%.?The improved standard would effectively control the quality of the Holotrichia diomphalia grub.

Key words：Holotrichia diomphalia grub;thin?layer chromatography （TLC）; heavy metal content; leachate; ash extract

蠐螬為金龜子科昆蟲(chóng)朝鮮黑金龜子Holotrichia diomphalia Bates及同屬近緣昆蟲(chóng)的干燥幼蟲(chóng)[1]。蠐螬在傳統(tǒng)中藥學(xué)中具有多種藥效價(jià)值，悠久的應(yīng)用歷史[2]，近年來(lái)，人們通過(guò)進(jìn)一步研究其藥用化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸、脂肪酸、酚性成分、多糖、礦物元素等[3-6]，藥理學(xué)研究表明蠐螬具有抗菌、抗腫瘤及治療心腦血管疾病等重要作用[7-9]，由于蠐螬重要的藥理作用，已被制成多種丸劑用于臨床疾病治療[10]。目前，對(duì)于蠐螬的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅在幾部地方標(biāo)準(zhǔn)中收錄，在鑒別上均未進(jìn)行深入研究，《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009版）、《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2012版）、《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（1994版）、《陜西省藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2015版）、《貴州省中藥及民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003版）幾乎都是對(duì)性狀特征和外部形狀進(jìn)行鑒別確定[11-15]，為了較為準(zhǔn)確、全面的評(píng)價(jià)蠐螬的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究通過(guò)增加蠐螬薄層鑒別、水分、灰分、浸出物及重金屬含量檢查，為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥品試劑

硅膠G板、高效硅膠G板、硅膠GF254板、硅膠H板（青島海洋化工廠），merck板（德國(guó)默克公司），HSGF254板（煙臺(tái)芝罘），茚三酮（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸對(duì)照品（上海麥克林生化科技有限公司），乙醇、正丁醇、冰醋酸（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

循環(huán)水式多用真空泵（SHB-IIIS，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），Biostep-AS30型半自動(dòng)點(diǎn)樣儀（德國(guó)迪賽克公司），CAMAG TLC Visualizer- 2型薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（德國(guó)CAMAG公司），F(xiàn)A1104型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司），SB-800 DTD型超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），METTLER TOLEDO-HR83水分測(cè)定儀（上海仁沃實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司），GZX-9146 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SX2-4-10箱式電阻爐（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3供試藥材

供試藥材來(lái)源情況見(jiàn)表1。

2方法與結(jié)果

2.1薄層鑒別法

2.1.1氨基酸薄層條件的探索

取干燥藥材粉末過(guò)4號(hào)篩，稱量1 g置于50 mL三角瓶中，加入10 mL的70%乙醇在20℃，70 Hz下超聲提取30 min，濾液作為供試品。吸取供試品溶液2 μL點(diǎn)于G硅膠薄層板上，用四種薄層展開(kāi)系統(tǒng)：a：正丁醇∶冰乙酸∶水=4∶1∶1;b：正丁醇∶冰乙酸∶水=8∶3∶1;c：正丁醇∶冰乙酸∶水=6∶3∶1;d：正丁醇∶冰乙酸∶水=5∶4∶1，分別展開(kāi)8 cm，取出晾干后噴0.2%茚三酮乙醇溶液，然后105℃烘箱烘5 min，顯色觀察。

最終確定展開(kāi)系統(tǒng)為正丁醇∶冰乙酸∶水=6∶3∶1，在此系統(tǒng)條件下，可以清晰看見(jiàn)4個(gè)點(diǎn)，且無(wú)拖尾現(xiàn)象。

2.1.2氨基酸成分的考察與確定

為了鑒別蠐螬薄層色譜中的氨基酸，我們采用20種氨基酸作為對(duì)照品以確定其種類。方法：采用20種氨基酸，分別用70%乙醇配制成1 mg/mL的溶液作為對(duì)照品。再分別吸取2 μL所制供試樣品和20種氨基酸對(duì)照品依次點(diǎn)于10 cm×20 cm默克板上，以正丁醇∶冰乙酸∶水=6∶3∶1為展開(kāi)劑展開(kāi)。展開(kāi)8 cm，取出，晾干，噴以0.2%茚三酮溶液，然后105℃烘箱烘5 min，顯色至斑點(diǎn)清晰。

通過(guò)Rf值與顏色可以大致確定樣品薄層色譜前三點(diǎn)為亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸。由于一些氨基酸Rf值接近，進(jìn)一步通過(guò)不同高效板確定。采用青島海洋高效G板分別對(duì)部分氨基酸進(jìn)行重復(fù)點(diǎn)樣展開(kāi)驗(yàn)證。

綜合兩次結(jié)果比對(duì)顏色與Rf值，確定薄層色譜前三點(diǎn)分別是：亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸。

2.1.3供試品溶液制備方法的考察與點(diǎn)樣量的考察

供試品溶液1：取藥材粉末1 g，加70%乙醇10 mL，超聲30 min后取濾液。供試品溶液2：取藥材粉末1 g，加70%乙醇10 mL，超聲15 min后取濾液。供試品溶液3：取藥材粉末1 g，加70%乙醇10 mL，超聲45 min后取濾液。供試品溶液4：取藥材粉末1 g，加乙醇10 mL，超聲30 min后取濾液。供試品溶液5：取藥材粉末1 g，加水10 mL，超聲30 min后取濾液。供試品溶液6：取藥材粉末1 g，加水10 mL，沸水浴回流3h后取濾液。根據(jù)薄層色譜法實(shí)驗(yàn)，吸取上述供試品2 μL與4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠HSG預(yù)制板上。

各點(diǎn)展開(kāi)差別不大，70%乙醇超聲提取30 min，點(diǎn)樣2 μL，結(jié)果斑點(diǎn)相對(duì)分離較完全，清晰。確定供試品點(diǎn)樣量2 μL，探索對(duì)照品點(diǎn)樣量，分別點(diǎn)1 μL（1 mol/mL）對(duì)照品，結(jié)果亮氨酸顯色不明顯，將亮氨酸點(diǎn)2 μL，各點(diǎn)清晰。

薄層鑒別（TLC）方法的確定：通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)研究，確定TLC鑒別方法為：取本品粉末1 g，加10 mL70%乙醇超聲處理30 min，濾液作為供試品溶液，另取亮氨酸，丙氨酸和纈氨酸對(duì)照品，加70%乙醇制成1 mg/mL對(duì)照品。吸取供試品溶液2 μL，對(duì)照品亮氨酸2 μL，丙氨酸，纈氨酸各1 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G板上，以正丁醇∶冰乙酸∶水（6∶3∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)取出，晾干噴以0.2%茚三酮溶液，加熱顯色，結(jié)果與對(duì)照品在相應(yīng)的位置有相同的斑點(diǎn)。

2.2方法耐用性考察

2.2.1薄層板的考察

吸取供試品溶液2 μL，對(duì)照品亮氨酸2 μL，丙氨酸、纈氨酸各1 μL，分別點(diǎn)于來(lái)源不同硅膠板上，以正丁醇∶冰乙酸∶水（6∶3∶1）展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi)，取出，晾干后噴以0.2%茚三酮溶液，105℃烘5 min，白光下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖可知四種板都能鑒別，默克板和青島H板分離效果相對(duì)較好。

2.2.2不同溫度考察

固定相對(duì)濕度為30%，分別吸取供試品溶液2 μL，對(duì)照品亮氨酸2 μL，丙氨酸，纈氨酸1 μL，分別點(diǎn)青島海洋G板上，分別在溫度4℃和室溫24℃條件下，用正丁醇∶冰乙酸∶水（6∶3∶1）展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi)，取出，晾干，后噴以0.2%茚三酮溶液，105℃加熱5 min，白光下檢視。由圖可知，在4℃～24℃范圍內(nèi)，溫度對(duì)其鑒別分離情況未產(chǎn)生明顯影響。

2.2.3不同濕度考察

固定溫度為24℃，分別吸取供試品溶液2 μL，對(duì)照品亮氨酸2 μL，丙氨酸，纈氨酸各1 μL，分別點(diǎn)青島海洋G板上，分別在18%和72%濕度下條件下，以正丁醇∶冰乙酸∶水（6∶3∶1）為展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi)，取出，晾干，再噴以0.2%茚三酮溶液，105℃加熱5 min，白光下檢視。結(jié)果如下圖，由圖可知這兩個(gè)濕度條件對(duì)其鑒別沒(méi)有多大的影響。

2.2.4四批蠐螬的氨基酸薄層鑒別

分別取貴州安順、河北安國(guó)、河南信陽(yáng)、安徽淮北按供試品溶液制備方法制備方法制備樣品，按確定的氨基酸薄層定性鑒別條件鑒別，結(jié)果如下，四批藥材均有亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸。

2.3檢查

2.3.1水分檢測(cè)

采用《中國(guó)藥典》（2015年版）四部通則0832第二法（烘干法）[16]進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示：四批藥材水分范圍為7.00%～8.56%。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，暫定水分不得超過(guò)10.0%，詳見(jiàn)表3。

2.3.2總灰分與酸不溶性灰分

按照《中國(guó)藥典》（2015年版）四部通則2302灰分測(cè)定法[16]，對(duì)4批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。暫定總灰分不得超過(guò)33.0%;暫定酸不溶性灰分不得超過(guò)13%。

2.3.3重金屬檢查

采用《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0821重金屬檢查第二法[16]，取總灰分項(xiàng)下的殘?jiān)瑢?duì)收集到的4批樣品進(jìn)行檢查，結(jié)果4管顯出的顏色都要淺于對(duì)照管的顏色。根據(jù)檢查結(jié)果，規(guī)定蠐螬含重金屬不得過(guò)30 ppm。

2.3.4浸出物

根據(jù)文獻(xiàn)得知，蠐螬的有效成分大部分為水溶性成分或醇溶性成分，故以水和不同濃度乙醇作為浸出溶劑，參考中國(guó)藥典2015年版四部通則2201[16]，對(duì)蠐螬進(jìn)行浸出物的測(cè)定研究。結(jié)果見(jiàn)表2。

以上數(shù)據(jù)表明，蠐螬熱浸出物的測(cè)定結(jié)果要高于對(duì)應(yīng)濃度冷浸出物，且50%熱浸條件浸出物最高，同時(shí)考慮到水條件下難以過(guò)濾，采用50%醇熱浸法測(cè)定浸出物。

照中國(guó)藥典中醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，對(duì)收集到的4批樣品進(jìn)行浸出物測(cè)定。結(jié)果4批樣品浸出物均值范圍為40.3091%～40.7904%，每批RSD范圍在0.9%～1.27%（n=3）。暫定蠐螬在50%醇熱浸出物不得少于39%。結(jié)果見(jiàn)表3。

3結(jié)論與討論

研究報(bào)道蠐螬中含有豐富的氨基酸[6]，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分別點(diǎn)樣20種氨基酸，比較Rf值和斑點(diǎn)顏色來(lái)確立與樣品展開(kāi)的對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，由于20種氨基酸在70%醇的溶解度各不相同且有些氨基酸Rf值接近，本實(shí)驗(yàn)先通過(guò)在同一塊硅膠上分別點(diǎn)20種2 μL 70%乙醇溶解的氨基酸，先根據(jù)與供試品展開(kāi)斑點(diǎn)的顏色與Rf值來(lái)大致確定幾種相對(duì)應(yīng)氨基酸，根據(jù)第一次結(jié)果適調(diào)整各種氨基酸點(diǎn)樣量和延長(zhǎng)展距，再換另一種高效硅膠板展開(kāi)，最后有效地確定與供試品薄層色譜對(duì)應(yīng)的前三個(gè)點(diǎn)由上到下依次為亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸。在檢查蠐螬浸出物時(shí)，由于蠐螬在不同醇濃度下浸出物濃度差別較大，通過(guò)探索比較5個(gè)不同醇濃度下冷浸和熱浸的浸出比例，在50%醇熱浸出物最高，設(shè)定在50%醇熱浸出物不得少于39%，有效地確定蠐螬浸出物的標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)對(duì)蠐螬質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究，有效控制了蠐螬的質(zhì)量。

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