自發(fā)性高血壓大鼠左心室肥厚的代謝組學(xué)研究

簡(jiǎn)維雄 肖隋熙 劉培 羅穎 陳偶英 馮宇 王健章 譚元生

〔摘要〕 目的 以血壓正常的wistar大鼠為對(duì)照，研究自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）左心室肥厚心肌組織的小分子產(chǎn)物變化。方法 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），對(duì)組織代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析；應(yīng)用偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）分析差異代謝產(chǎn)物譜。依據(jù)變量重要性（VIP）、自變量系數(shù)探索SHR發(fā)生左心室肥厚心肌時(shí)代謝產(chǎn)物。結(jié)果 與SHR組呈正相關(guān)的是：90角鯊烯、51對(duì)苯二甲酸、87麥芽糖、68棕櫚油酸、77葡萄糖-6-磷酸1、8 2-羥基丁酸、78未知、74油酸、56果糖1、28三氰丙氨酸；負(fù)相關(guān)的是：21琥珀酸、24富馬酸、2丙酮酸、34天門(mén)冬氨酸1、85未知、45未知、88甘油單油酸酯、86 油精。結(jié)論 進(jìn)一步證實(shí)高血壓導(dǎo)致的左心室肥厚與心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞以及能量失衡密切相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 SHR；左心室肥厚；代謝組學(xué)

〔中圖分類號(hào)〕R544.1；R393 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.001

〔Abstract〕 Objective To investigate the changes of small molecular products in left ventricular hypertrophyof spontaneously hypertensive rats（SHR）， the Wistar rats with normal pressure as the control group. Methods The metabolites were detected by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）， and the differences of metabolite were analyzed by partial least squares （partial least squares discriminant analysis， PLS-DA）. According to the variable importance（VIP） and independent variable coefficients， the left ventricular hypertrophy and myocardial age products in SHR rats were investigated. Results SHR group was positively correlated with： 90 squalene， 51 terephthalic acid， 87 maltose， 68 palmitoleic acid， 77 glucose-6-phosphate 1， 8 2-hydroxybutyric acid， 78 unknown， 74 oleic acid， 56 fructose 1， 28 three cyanogens alanine. Negative related with： 21 succinate， 24 fumarate， 2 pyruvic acid， 34 aspartic acid 1， 85 unknown， 45unknown， 88 glycerol ester of single oil， 86 olein. Conclusion It is further confirmed that the left ventricular hypertrophy induced by hypertension is closely related to the destruction of myocardial cell structure and the imbalance of energy.

〔Keywords〕 SHR； left ventricular hypertrophy； metabonomics

自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）是研究高血壓疾病的經(jīng)典鼠種，研究發(fā)現(xiàn)，在第14周齡時(shí)，SHR的左心室質(zhì)量和左心室質(zhì)量指數(shù)已經(jīng)顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明此時(shí)左室肥厚已經(jīng)基本形成[1]。代謝組學(xué)是研究關(guān)于生物體系（細(xì)胞、組織、生物體）受外部刺激或干擾后發(fā)生的內(nèi)源性所有代謝物的定量分析科學(xué)。它所關(guān)注的是代謝循環(huán)中分子量小于1 000的小分子代謝物的變化[2-3]。本項(xiàng)目將進(jìn)行SHR左心室肥厚的代謝組學(xué)研究以期探索其小分子物質(zhì)變化規(guī)律，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物

選用SPF級(jí)12周齡自發(fā)性高血壓大鼠（SHR） 8只，雄性，同齡血壓正常的（wistar-kyoto，WKY）大鼠8只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，大鼠及飼料均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（SHR大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格許可編號(hào)：20141020，飼料購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），飼養(yǎng)環(huán)境溫度（20.0±2.0） ℃，相對(duì)濕度45% ～70%。自由飲食飲水，早上8點(diǎn)至下午5點(diǎn)自動(dòng)燈光照明。

1.2 試劑

L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司，中國(guó)），BSTFA（含1%TMCS，v/v）（REGIS Technologies. Inc. USA.）

1.3 儀器

Agilent 7890A氣相色譜儀， 美國(guó)；LECOChroma TOF PEGASUS HT質(zhì)譜儀，美國(guó)；JXFSTPRP-24研磨儀，中國(guó)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

8只SHR為模型組，8只照WKY為空白對(duì)照組，自由食水喂養(yǎng)2周，密切觀察所有實(shí)驗(yàn)大鼠的精神、飲食、飲水、呼吸、活動(dòng)力等狀況。處死后立即解剖取心臟標(biāo)本。

2.2 代謝物萃取

（1）取50 mg心肌樣本于2 mL EP管里，加入0.4 mL甲醇-氯仿（3∶1），再加入20 μL L-2-氯苯丙氨酸，加入鋼珠，研磨儀（65 Hz）勻漿研磨處理 3 min；（2）4 °C， 12 000 r/min離心15 min；（3）小心地取出350 μL上清于2 mL進(jìn)樣瓶（甲烷硅基化的）中；（4）質(zhì)控樣本：每個(gè)樣本取約10 μL（根據(jù)樣本量而定）于2 mL進(jìn)樣瓶中，混勻。

2.3 代謝物衍生化

（1）在真空濃縮器中37 °C干燥上述提取物， 大約3.5 h；（2）向干燥后的代謝物加入80 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中80 °C孵育20 min；（3）向每個(gè)樣品中迅速加入100 μL BSTFA（含有1% TCMS，v/v），將混合物70 °C孵育1h；（4）冷卻至室溫，向混合的樣本中加入5 μL FAMEs（飽和脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)混合液，溶于氯仿C8-C16∶1 mg/mL；C18-C24∶0.5 mg/mL）；（5）混勻，上機(jī)檢測(cè)。

2.4 上機(jī)檢測(cè)

Agilent 7890氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀配有Restek Rxi-5Sil MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）， Restek，USA。GC-TOF-MS具體分析條件如下，進(jìn)樣量：1 μL，不分流模式；載氣：氦氣；前進(jìn)樣口吹掃流速：3 mL/min；柱流速：1 mL/min；柱溫：60 °C保持1 min，以10 °C每分鐘的速率上升至330 °C，保持10 min；前進(jìn)樣口溫度：280 °C；傳輸線溫度：280 °C；離子源溫度：220 °C；電離電壓：-70eV；掃描方式：85～600 m/z；掃描速率：20 spectra/sec；溶劑延遲：366 s。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

根據(jù)GC-MS總離子流圖中各峰的保留時(shí)間挑選共有峰（各圖譜中共有的色譜峰），獲取各峰與內(nèi)標(biāo)峰的峰面積數(shù)據(jù)，用相對(duì)峰面積（與內(nèi)標(biāo)峰的比值）表示代謝物的含量。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）應(yīng)用SIMCA-2P 11.5軟件。

3 結(jié)果與分析

3.1 總離子流圖

大鼠組織GC-MS分析總離子流圖如圖1所示。

3.2 代謝物鑒定

共有峰挑選后發(fā)現(xiàn)組織中共有內(nèi)源性代謝物93種，利用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共有的內(nèi)源性代謝物作鑒定，以通常匹配度大于700的鑒定結(jié)果作為較為可信的物質(zhì)。見(jiàn)表1。

3.3 兩組大鼠心肌組織PLS-DA

將血漿93種代謝產(chǎn)物通過(guò)主成分分析，進(jìn)行SHR組、WKY組2組模式識(shí)別（圖2）。結(jié)果顯示：SHR組在得分圖左下方主要在第三象限，WKY組在右側(cè)偏上方主要在第一象限；SHR與WKY組呈現(xiàn)出良好的分離。因子載荷圖顯示（圖3）：與SHR相關(guān)的變量集中在第三象限比如：87、9、43、51、77、78、65、56、74。與WKY相關(guān)的變量集中在第一、四象限比如：24、34、85、86、75、21、93、2、88。

自變量VIP（>1.2）系數(shù)圖顯示（圖4）：引起組別差異的自變量依據(jù)重要性排序的是90角鯊烯、51對(duì)苯二甲酸、87麥芽糖、21琥珀酸、68棕櫚油酸、77葡萄糖-6-磷酸1、8 2-羥基丁酸、24富馬酸、74油酸、2丙酮酸、78未知、45未知、85未知、34天門(mén)冬氨酸1、56果糖1、88甘油單油酸酯、862油精、28三氰丙氨酸。

SHR組與WKY組兩組間自變量系數(shù)圖顯示（圖5）：與SHR組呈正相關(guān)的系數(shù)是：90角鯊烯、51對(duì)苯二甲酸、87麥芽糖、68棕櫚油酸、77葡萄糖-6-磷酸1、8 2-羥基丁酸、78未知、74油酸、56果糖1、28三氰丙氨酸。負(fù)相關(guān)的是：21琥珀酸、24富馬酸、2丙酮酸、34天門(mén)冬氨酸1、85未知、45未知、88甘油單油酸酯、86油精（圖4，5橫坐標(biāo)為代謝產(chǎn)物ID，縱坐標(biāo)為變量系數(shù)）。

4 討論

4.1 代謝產(chǎn)物變化趨勢(shì)分析

PLS結(jié)果發(fā)現(xiàn)與在SHR組水平上調(diào)的物質(zhì)有：90角鯊烯、51對(duì)苯二甲酸、87麥芽糖、68棕櫚油酸、77葡萄糖-6-磷酸1、8 2-羥基丁酸、78未知、74油酸、56果糖1、28三氰丙氨酸。水平下調(diào)的物質(zhì)有：21琥珀酸、24富馬酸、2丙酮酸、34天門(mén)冬氨酸1、85未知、45未知、88甘油單油酸酯、86油精。初步閱讀代謝產(chǎn)物，從已鑒定的物質(zhì)分析主要涉及脂肪酸與氨基酸、糖類，綜合分析主要涉及能量代謝，為此本文從能量代謝的角度分析了心肌肥厚。在心肌肥大的發(fā)生和進(jìn)程中，由于負(fù)荷性心肌能量需求增加，以及能量的相對(duì)不足，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的產(chǎn)能機(jī)構(gòu)也出現(xiàn)明顯的適應(yīng)性改變，正常心肌以線粒體中進(jìn)行的脂肪酸酸β氧化（FAO）做為主要能量來(lái)源，而葡萄糖氧化在心肌能量供應(yīng)中所起作用較小。在心肌病理性肥厚時(shí)，胚胎型的肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶同工酶的含量及活性均有明顯提高，肥厚心肌細(xì)胞能量來(lái)源發(fā)生改變，從脂肪氧化過(guò)度到葡萄糖氧化，同時(shí)代謝途徑從有氧氧化向無(wú)氧酵解轉(zhuǎn)化[4]。心肌細(xì)胞中脂肪酸β氧化減少，游離脂肪酸（FFA）增加。這種轉(zhuǎn)變能夠在消耗同樣氧氣的條件下產(chǎn)生更多的ATP，可能是對(duì)心肌肥厚時(shí)缺血缺氧的一種適應(yīng)性變化。但長(zhǎng)期以糖為氧化底物會(huì)引起游離脂肪酸在心肌細(xì)胞內(nèi)積聚，對(duì)細(xì)胞膜和膜結(jié)合蛋白活性產(chǎn)生損害，同時(shí)引發(fā)能量利用障礙。因此心肌脂肪酸、糖原氧化障礙可能參與了心肌肥厚的形成與維持[5]。

在水平上調(diào)的物質(zhì)中角鯊烯是一種參與多種生化反應(yīng)、具有多功能的生物活性物質(zhì)，是固醇生物合成重要的前體物質(zhì)，作為細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的組分是機(jī)體內(nèi)不可或缺的生命物質(zhì)。這有可能是心肌細(xì)胞肥大時(shí)細(xì)胞膜的損傷，可以導(dǎo)致角鯊烯水平上調(diào)。角鯊烯具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化功能，同時(shí)還具有加快超氧化酶和乳酸脫氧酶活力，增強(qiáng)吸收氧的能力，從而加快乳酸分解，強(qiáng)化能量代謝的作用[6]。心肌肥厚時(shí)角鯊烯抗脂質(zhì)過(guò)氧化功能顯然影響心肌細(xì)胞的脂質(zhì)氧化，起保護(hù)作用。而乳酸分解的過(guò)程是可以給相對(duì)能量不足的心肌帶來(lái)更多的ATP，但這有可能會(huì)加重脂肪酸酸類物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的堆積，加重心肌的損傷。

苯二甲酸（TPA）是世界上廣泛使用的一種化學(xué)物，被廣泛用于合成樹(shù)脂、薄膜、聚醋纖維等，還可用于紡織品中的堿化劑以及家禽的飼料添加劑。SHR體內(nèi)對(duì)苯二甲酸水平上調(diào)是否與苯基脂肪酸分解相關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

麥芽糖是由2分子葡萄糖通過(guò)α-1，4糖苷鍵連接而成的雙糖，由麥芽糖酶水解成2分子葡萄糖，參加三羧酸循環(huán)代謝后為機(jī)體提供能量。體內(nèi)不能合成麥芽糖，多是經(jīng)飲食后進(jìn)入組織細(xì)胞，在麥芽糖酶的作用下轉(zhuǎn)化成葡萄糖。組織內(nèi)麥芽糖水平的上調(diào)，考慮是麥芽糖酶的缺乏。麥芽糖酶缺乏的原因可能與心肌細(xì)胞肥大后喪失部分細(xì)胞功能有關(guān)，而糖原的增加導(dǎo)致在溶酶體和細(xì)胞漿內(nèi)大量積聚，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷[7]。

己有實(shí)驗(yàn)證實(shí)在SHR（15周齡，中度心肌肥厚）中，發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化能力增強(qiáng)，而脂肪酸氧化受抑，導(dǎo)致其聚集在細(xì)胞內(nèi)，能量底物從長(zhǎng)鏈脂肪酸β氧化為主轉(zhuǎn)向以糖類氧化為主[8]。脂肪酸β-氧化也是脂肪酸的改造過(guò)程，機(jī)體所需要的脂肪酸鏈的長(zhǎng)短不同，通過(guò)β-氧化可將長(zhǎng)鏈脂肪酸改造成長(zhǎng)度適宜的脂肪酸，供機(jī)體代謝所需，比如油酸、棕櫚油酸。

油酸是一種單不飽和脂肪酸，人體血液內(nèi)的油酸分為外源性油酸和內(nèi)源性油酸。外源性的油酸從飲食中獲得， 內(nèi)源性的油酸是通過(guò)硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）生成的。SCD可以將棕櫚酸和硬脂酸化生成棕櫚油酸和油酸，這些脂肪酸是膜磷脂、甘油三酯、膽固醇酯等的必需組成部分[9]。棕櫚油酸是十六碳不飽和脂肪酸磷脂水解的產(chǎn)物，還是前列腺素、白細(xì)胞三烯、血栓烷的前體物質(zhì)。在SHR中油酸、棕櫚油酸水平增高考慮是細(xì)胞膜在各種因素作用下?lián)p傷導(dǎo)致[10-11]以及脂肪酸β氧化的結(jié)果。但也不能排除是SCD的作用，SCD是催化單不飽和脂肪酸的限速酶，目前其調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，但有證據(jù)表明葡萄糖、果糖可以誘導(dǎo)SCD活性[12]。

葡萄糖-6-磷酸不僅是糖酵解途徑的第一個(gè)產(chǎn)物，也是磷酸戊糖途徑的起始底物，除此之外它也是糖異生途徑的中間產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸由葡萄糖經(jīng)過(guò)葡萄糖激酶催化并消耗ATP得來(lái)，這步反應(yīng)因?yàn)槭遣豢赡娣磻?yīng)且消耗ATP，所以是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速反應(yīng)。在肥厚的心肌中糖酵解活性增強(qiáng)，更多的選擇葡糖糖、而不是脂肪酸，這就使得葡萄糖激酶活性增強(qiáng)，葡萄糖-6-磷酸水平增高。而葡萄糖激酶活性增強(qiáng)極有可能促進(jìn)蛋白激酶C，從而進(jìn)一步促使心肌肥厚的進(jìn)展[13-15]。

2-羥基丁酸可在乳酸脫氫酶的作用下由α-丁酮酸形成。而α-丁酮酸是蘇氨酸的降解產(chǎn)物之一，由蘇氨酸脫氨酶脫氨而來(lái)；可以是胱硫醚由高半胱氨酸和絲氨酸通過(guò)胱硫醚β-合成酶（CBS）合成，再由胱硫醚γ-裂解酶（CSE）裂解為半胱氨酸和α-丁酮酸[16]。雖然已有的研究證實(shí)在高血壓疾病時(shí)CBS/CSE呈現(xiàn)出低表達(dá)，但考慮已有針對(duì)CBS/CSE的研究報(bào)告多是從血管內(nèi)皮系統(tǒng)出發(fā)，心肌組織的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。有研究表明高血壓心肌組織中半胱氨酸的高表達(dá)，可以推測(cè)在組織中CBS/CSE可能呈現(xiàn)出高表達(dá)，導(dǎo)致α-丁酮酸生成，在已經(jīng)激動(dòng)的乳酸脫氫酶作用生成2-羥基丁酸。

果糖是左旋性的六碳酮糖，是葡萄糖的同分異構(gòu)體，己糖激酶在ATP的作用下轉(zhuǎn)化為1-磷酸果糖，然后進(jìn)一步代謝為甘油醛、磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛，從而進(jìn)入與葡萄糖代謝過(guò)程。但是心肌肥大后細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致ATP相對(duì)缺乏，而己糖激酶對(duì)葡萄糖的親和力比對(duì)果糖的親和力高12倍，隨著能量代謝向葡萄糖氧化轉(zhuǎn)移，為此導(dǎo)致果糖蓄積，與麥芽糖相同，蓄積在細(xì)胞內(nèi)則會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷的發(fā)生。

用于產(chǎn)能的底物明顯下降，三羧酸循環(huán)的正常功能將受到抑制。這可能與三羧酸循環(huán)酶的功能損傷有密切關(guān)系。三羧酸循環(huán)（TCA cycle）是有氧代謝的主要途徑，普遍存在于需氧生物體內(nèi)，包括高等動(dòng)植物及低等的細(xì)菌、微生物的線粒體內(nèi)。線粒體在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞骨架通常形成一個(gè)復(fù)雜的三維分支結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞骨架的關(guān)系決定著線粒體的形狀，從而影響其功能。因?yàn)樾募〖?xì)胞的肥大可以導(dǎo)致細(xì)胞骨架的改變，同時(shí)肥大后各種損傷因素都可以導(dǎo)致線粒體功能的的損傷。功能的損傷必定導(dǎo)致三羧酸循環(huán)的底物水平的下調(diào)，琥珀酸、富馬酸、草酰乙酸是循環(huán)底物，正如此才導(dǎo)致琥珀酸、富馬酸水平下調(diào)。天冬氨酸是一種α-氨基酸，由草酰乙酸發(fā)生氧化脫羧生成丙酮酸。故天冬氨酸、丙酮酸水平也呈現(xiàn)下調(diào)。

2-甘油單油酸酯與甘油單油酸酯在細(xì)胞中可以由L-α-磷酸甘油和脂酰輔酶A合成，L-α-磷酸甘油來(lái)源有兩個(gè)，一個(gè)是肝臟中在甘油激酶的催化下由甘油與ATP合成。但心肌組織中顯然是第二種來(lái)源，磷酸二羥基丙酮在α-甘油磷酸脫氫酶作用下以NADH為輔酶還原而成，這其中的磷酸二羥基丙酮是糖酵解中縮醛酶的產(chǎn)物，在心肌肥厚細(xì)胞三羧酸循環(huán)功能障礙下，這種產(chǎn)物可能不足，為此2-甘油單油酸酯與甘油單油酸酯水平呈現(xiàn)下調(diào)。

4.2 結(jié)論

本研究進(jìn)一步證實(shí)了心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞后的能量轉(zhuǎn)化以及能量失衡理論。高血壓左心室肥厚，是心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞間質(zhì)增生的結(jié)果。心肌細(xì)胞肥大，失去了其原來(lái)固有的組織構(gòu)架，可以表現(xiàn)在細(xì)胞膜、線粒體膜的破壞在磷脂分解后可以導(dǎo)致角鯊烯、棕櫚油酸這一類物質(zhì)水平的上調(diào)。細(xì)胞失去原固有組織構(gòu)架必然會(huì)導(dǎo)致其某些功能的失衡，可以導(dǎo)致麥芽糖激酶減少，麥芽糖分解減少，水平上調(diào)。心肌細(xì)胞的肥大，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)相對(duì)缺氧，在這種條件下，細(xì)胞氧化途徑發(fā)生改變，由脂肪酸β氧化轉(zhuǎn)移至糖氧化，這將直接導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸堆積油酸、棕櫚油酸水平上調(diào)。葡萄糖氧化途徑增強(qiáng)可導(dǎo)致葡萄糖-6-磷酸水平上調(diào)，這個(gè)過(guò)程中在激活的酶如氨酸脫氫酶作用下2-羥基丁酸水平上調(diào)。由于葡萄糖激酶的競(jìng)爭(zhēng)力要強(qiáng)于果糖激酶，這將導(dǎo)致果糖堆積細(xì)胞內(nèi)，這個(gè)過(guò)程也是缺氧的。三羧酸循環(huán)功能在細(xì)胞器結(jié)構(gòu)受損的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步受到影響。故三羧酸循環(huán)底物以及其附屬產(chǎn)物呈低水平狀態(tài)，體現(xiàn)在琥珀酸、富馬酸、丙氨酸、天冬氨酸。

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