3種藍(lán)細(xì)菌藻藍(lán)蛋白β亞基脫輔基蛋白基因的克隆、表達(dá)及重組蛋白的抗氧化活性

伍賢軍 楊紅 盛怡 冷倩男 李萍萍

摘要： 為研究藍(lán)細(xì)菌藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白的抗氧化活性，分別從3種藍(lán)細(xì)菌Spirulina subsalsa、Mastigocladuslarmnosus和Nostoc PCC 7120中克隆C一藻藍(lán)蛋白β亞基編碼基因cpc Bsp、cpcBMa和cpcBNo，在大腸桿菌中表達(dá)，獲得了重組蛋白CpcBsp、Cpc BMa和CpcBNo。通過(guò)測(cè)定其對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除率，比較它們的抗氧化活性。結(jié)果顯示：3種重組蛋白對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除率都隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增加而升高。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度達(dá)到250 mg/L時(shí)，CpcBsp、CpcBMa和CpcBNo對(duì)羥基自由基的清除率分別為82%、89%和93%，對(duì)DPPH自由基的清除率分別為43010、49010和58010。以上結(jié)果表明，3種重組藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白都具有較高的抗氧化活性，有潛力作為醫(yī)療上使用的抗氧化試劑，不同藍(lán)細(xì)菌的同源藻藍(lán)蛋白的抗氧化能力存在一定差異，選擇不同藍(lán)細(xì)菌的藻藍(lán)蛋白是提高重組藻藍(lán)蛋白抗氧化能力的有效途徑，

關(guān)鍵詞：藻藍(lán)蛋白;抗氧化活性;重組蛋白;自由基

中圖分類號(hào)：TS202.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)： 1000-4440（2018） 05-0998-07

藻藍(lán)蛋白（Phycocyanin，PC）是某些藻類中結(jié)合四吡咯色素分子，具有藍(lán)色的捕光色素蛋白復(fù)合物，C-藻藍(lán)蛋白（C-PC）是其主要的類型。C-PC由α和β亞基組成，在天然條件下，通常以（αβ）、（αβ）3或（αβ）6等多聚體的形式存在。藻藍(lán)蛋白亞基由藻藍(lán)色素和相應(yīng)的脫輔基蛋白共價(jià)偶聯(lián)而成。C-PC具有良好的生物相容性、無(wú)毒性、水溶性、獨(dú)特的顏色以及在可見光區(qū)強(qiáng)烈的吸收和熒光，所以廣泛使用在食品、化妝品、生物技術(shù)和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。C-PC展現(xiàn)強(qiáng)烈的抗氧化效應(yīng)，比如對(duì)過(guò)氧化氫自由基、烷基自由基和羥基自由基的清除活性。同時(shí)C-PC也有抗炎癥、抗病菌、抗癌細(xì)胞以及保護(hù)神經(jīng)的醫(yī)療效用。由于大多數(shù)病理特征伴隨著活性氧自由基（ROS）的產(chǎn)生，所以，這些醫(yī)療特性也和C-PC的抗氧化性密切相關(guān)。

C-PC 一般從天然的藻類中直接提取，也能在大腸桿菌中重組產(chǎn)生。研究結(jié)果表明，重組C-PC比天然的C-PC具有更強(qiáng)的抗氧化能力。C-PC的抗氧化機(jī)理最初主要認(rèn)為僅是色素的抗氧化性，通過(guò)克隆藻藍(lán)蛋白的編碼基因，在大腸桿菌中表達(dá)藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白，驗(yàn)證了脫輔基蛋白也具有抗氧化活性。這表明C-PC的抗氧化性不僅有色素的作用，還包括脫輔基蛋白的貢獻(xiàn)。色素蛋白的生物合成過(guò)程復(fù)雜且不穩(wěn)定，不僅需要藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白，還需要與血紅素氧化酶、色素還原酶以及裂合酶共表達(dá)，而僅用藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白則更為簡(jiǎn)單可靠。

盡管藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白具有抗氧化特征，但其抗氧化機(jī)制尚不清楚。不同藻類藻藍(lán)蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和氨基酸組成存在一定的差異，這些差異可能會(huì)影響其抗氧化能力。本研究從螺旋藻Spirulinasubsatsa、層理鞭枝藻Mastigocladus laminosus和魚腥藻Nostoc PCC 7120中克隆藻藍(lán)蛋白β亞基CpcBsP、CpcBMa和CpcBNo的編碼基因，分別在大腸桿菌中表達(dá)，產(chǎn)生重組蛋白，并通過(guò)測(cè)定重組蛋白對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除能力評(píng)估不同藍(lán)細(xì)菌重組蛋白的抗氧化活性，為研究藻藍(lán)蛋白的抗氧化性機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螺旋藻Spirulina subsalsa、層理鞭枝藻Mastigo-cladus laminosus和魚腥藻Nostoc PCC 7120購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，克隆載體pUC19購(gòu)自TaKaRa公司，表達(dá)載體pETDuet-l購(gòu)自Novagen公司。表達(dá)宿主菌Escherichia coli BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室提供。

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、BCA蛋白質(zhì)定量分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，DNA marker、蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自安諾倫（北京）生物科技有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒、Taq酶、dNTP和其他PCR試劑均購(gòu)自天根（北京）生物科技有限公司，IPTG（異丙基β-D-硫代半乳糖苷）購(gòu)自博奧拓達(dá)（北京）科技有限公司，蛋白胨（Tryp-tone）和酵母粉（Yeast Extract）為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品，氨芐西林為韓國(guó)Biosharp公司產(chǎn)品，其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成和基因測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

Labcycler PCR儀，德國(guó)SensoQuest公司產(chǎn)品;Lambda 365紫外/可見分光光度計(jì)，美國(guó)Perkin El-mer公司產(chǎn)品：LS55熒光分光光度計(jì)，美國(guó)PerkinElmer公司產(chǎn)品：MIKR0 200R小型微量冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hettich公司產(chǎn)品：GenoSens1850凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科技有限公司產(chǎn)品;恒溫混勻器，美國(guó)Grant公司產(chǎn)品：JY96-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品;Bio-Rad蛋白質(zhì)電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品：DNA電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 藍(lán)細(xì)菌的培養(yǎng)和基因組DNA的提取

參照文獻(xiàn)、的方法培養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌Spiruli-na subsalsa、Mastigocladus lamin，osus和Nostoc PCC7120。

藍(lán)細(xì)菌基因組DNA的提取參照朱萬(wàn)鵬的方法。離心收集的藍(lán)細(xì)菌重懸于TE（pH8.0）緩沖液中，向重懸的菌液中加入適量十二烷基硫酸鈉（SDS）和石英砂，在振蕩器上振蕩，盡量使細(xì)胞全部破碎。用酚/氯仿/異戊醇（體積比25∶24∶1）的混合液抽提2次，離心取上清液，再用氯仿抽提1次，離心取上清液，加入2倍體積無(wú)水乙醇，-20℃沉淀30min，離心沉淀DNA.溶于20μl TE緩沖液備用。

1.4 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Nostoc PCC 7120 C-藻藍(lán)蛋白編碼基因cpcBNo（GenBanK登錄號(hào)：NC_003272）、Mastigocladus laminosus C-藻藍(lán)蛋白編碼基因cpcBMa（GenBanK登錄號(hào)：WP-009454964）和Spirulinasubsalsa C-藻藍(lán)蛋白編碼基因cpcBSp（GenBank登錄號(hào)：AY804216）的DNA序列設(shè)計(jì)引物，引物序列見表l。PCR條件：94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)：最終72 cC延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后，送至金斯瑞基因公司測(cè)序。

1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

為了構(gòu)建表達(dá)載體，鑒定后的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Sac I和Hind III雙酶切，插入經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的空載體pETDuet-l，用CaCl，法轉(zhuǎn)化到已經(jīng)制備好的感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coli DH5a.涂布在加有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃過(guò)夜倒置培養(yǎng)16 h，挑取單菌落于5 ml LB液體培養(yǎng)基，37℃、250 r/min振蕩8h，小量提取重組質(zhì)粒，用Sac I和Hind III雙酶切質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。重組質(zhì)粒用CaCl，法轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌Escherichia coli BL21（DE3）中，獲得含重組質(zhì)粒的重組菌株，并用50%的甘油與菌液以體積比為1∶2的比例混勻，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 目的蛋白的表達(dá)、純化及SDS·PAGE電泳

將重組菌株接種到5 ml含100 mg/L氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床37℃、250r/min培養(yǎng)10 h.接種3 ml濃菌液到300 ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，直到OD600為0.4～0.5左右，冰浴30 min.加入終濃度為1 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG置于搖床誘導(dǎo)表達(dá)，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，表達(dá)溫度為20℃，表達(dá)時(shí)間為12 h。用臺(tái)式離心機(jī)6500 r/min收集表達(dá)后的細(xì)胞，用去離子水清洗3遍，加入磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L KH2PO4-K2HP04+500 mmol/L NaCl，pH 7.2）充分懸浮細(xì)胞，取少量的細(xì)胞制備樣品，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳，對(duì)重組蛋白進(jìn)行分析和鑒定。其余通過(guò)超聲破碎儀裂解破碎（400 W，超聲5s，間歇10 s，共超聲15 min），裂解液4℃、12 000 r/min離心30 min，收集包含可溶性目的蛋白的上清液。

由于表達(dá)載體的N端融合了組氨酸His標(biāo)簽，故可以利用鎳離子親和層析柱（GE Healthcare）進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化。結(jié)合鎳離子的親和層析膠用Startbuffer平衡液處理后，加入收集到的上清液，用10倍的StaIt buffer平衡液沖洗，再用2倍體積包含50mmol/L咪唑的Start buffer進(jìn)行沖洗，最后用包含500 mmol/L咪唑的Start buffer收集重組蛋白溶液。蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋，置于透析緩沖液（50mmol/L KPB緩沖液，500 mmol/L NaCl，pH 7.2）中透析8—12 h以充分去除咪唑，透析期間更換透析液。使用BCA蛋白定量分析試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取少量蛋白質(zhì)制備樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，對(duì)重組蛋白進(jìn)行分析和鑒定。

1.7 羥基自由基清除率測(cè)定

利用稍作修改后的脫氧核糖法評(píng)估蛋白質(zhì)對(duì)羥基自由基的清除能力。方法如下：配制包含20mmol/L KPB緩沖液（KH2P04-K2HP04，pH7.2）、2.8mmol/L脫氧核糖、1mmol/L雙氧水、100μmol/L EDTA的反應(yīng)液，往反應(yīng)液中加入樣品，使樣品在反應(yīng)液中的終濃度分別為50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml，往反應(yīng)液中加入終濃度為100μmol/L的抗壞血酸和100μmol/L三氯化鐵（FeCl3）以啟動(dòng)反應(yīng)，總體積為500μl的反應(yīng)體系置于37 cC中保持30 min，加入250μl三氯乙酸（質(zhì)量濃度為2.8%，溶于去離子水）終止反應(yīng)，加入250μl硫代巴比妥酸（TBA，質(zhì)量濃度為1%，溶于50 mmol/L NaOH），煮沸15 min進(jìn)行顯色反應(yīng)，1 ml反應(yīng)液冷卻后用20mmol/LKPB緩沖液稀釋2倍（pH 7.2），測(cè)定532 nm處的吸光度。陽(yáng)性對(duì)照甘露醇和蛋白質(zhì)樣品的吸光度為A1，空白對(duì)照20 mmol/L KPB緩沖液吸光度為Ao，則羥基自由基的清除活性計(jì)算公式為：羥基自由基清除活性=[（Ao-A1）/Ao] xl00%。

1.8 DPPH自由基清除率測(cè)定

參照Ping等的方法進(jìn)行DPPH自由基清除試驗(yàn)，稍作修改。加入1ml終濃度分別為50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml的重組蛋白樣品到2 ml含有6.5×10-5mol/LDPPH的甲醇溶液中，混勻.25℃避光靜置30 min，測(cè)定517nm處的吸光度。DPPH自由基清除率計(jì)算公式：清除率=[（A0-A1+A2）/A0] xl00%，式中，Ao為未加樣品的吸光度，A1為樣品吸光度，A2為空白（未加DPPH）吸光度。用抗壞血酸Vc作為參照。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，取平均值。應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種藍(lán)細(xì)菌藻藍(lán)蛋白β亞基的同源性

利用CLUSTALW（2.1）軟件將3種藍(lán)細(xì)菌Spir-ulina subsalsa、Mastigocladus lamirzosus和Nostoc PCC7120的C-藻藍(lán)蛋白β亞基（CpcBsp、CpcBMa和CpcBN0）氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果（圖1）顯示，3種C-藻藍(lán)蛋白β亞基的氨基酸序列同源性為79%。其中，CpcBsp和CpcBMa的同源性為84%，CpcBsp和CpcBNo的同源性為85%，CpcBMa和CpcBN0的同源性為90%。它們之間表現(xiàn)出較高的同源性，但也具有一定的差異。

2.2 藻藍(lán)蛋白β亞基編碼基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

提取藍(lán)藻Spirulina subsalsa、Mastigocladus lamin-OSus和Nostoc PCC 7120的基因組DNA。以NostocPCC 7120基因組DNA為模板，Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得500 bp左右的DNA條帶（圖2），PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示其堿基序列與已報(bào)道的Nostoc PCC 7120中的cpcB完全一致，命名為cpcBNo;以Mastigocladus laminosus基因組DNA為模板，P3和P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得500 bp左右的DNA條帶，PCR產(chǎn)物堿基序列與已報(bào)道的Mastigocladus lamin-osus中的cpcB完全一致，命名為cpcBMa;以Spirulinasubsalsa基因組DNA為模板，P5和P6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得500 bp左右的DNA條帶，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示其大小為519 bp，與目的基因大小一致，命名為cpcBsp，其基因堿基序列與已報(bào)道的Spirulina subsalsa中cpcB的相似度為90%，翻譯后的氨基酸序列相似度為95%，跨度為100%。

2.3 重組質(zhì)粒pETDuet-cpcBNo、pETDuet-cpcBMa和pETDuet-cpcBSp的構(gòu)建

將擴(kuò)增得到的目的基因cpcBNo、cpcBMa、cpcBSp和表達(dá)載體pETDuet-l分別進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化并回收酶切產(chǎn)物，過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，置于恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，提取重組質(zhì)粒pETDuet-cpcBNo、pETDuet-cpcBMa和pETDuet-cpcBsp。新質(zhì)粒分別用Sac I和Hind III雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，在500 bp左右處觀察到DNA條帶，與預(yù)測(cè)的目的基因大小一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 重組藻藍(lán)蛋白的表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒pETDuet-cpcBNo、pETDuet-cpcBMa和pETDuet-cpcBs轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)，產(chǎn)生重組蛋白CpcB，Vo、Cpc BMa和CpcBSp。收集的細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖4）顯示目的蛋白分子量為2.Oxl04左右，與預(yù)期基本相符。用親和層析法提純重組蛋白后，進(jìn)一步進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖4）顯示蛋白質(zhì)大小和預(yù)期的基本一致，目的條帶清晰，沒(méi)有雜帶，純度較高。

2.5 3種重組藻藍(lán)蛋白的抗氧化性

測(cè)定不同質(zhì)量濃度的重組蛋白CpcB No、CpcBMa和CpcBSp的抗氧化能力，包括對(duì)羥基自由基和DP-PH自由基的清除能力。結(jié)果（圖5）表明，重組蛋白對(duì)羥基自由基的清除率依賴于所測(cè)重組蛋白的質(zhì)量濃度，隨著重組蛋白的質(zhì)量濃度的增加而不斷升高。質(zhì)量濃度為50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml的CpcBSp對(duì)羥基自由基的清除能力分別為45%、71%、73%、79%和82%，不同質(zhì)量濃度CpcBwa對(duì)羥基自由基的清除能力分別為51%、72%、76%、83%和89%，不同質(zhì)量濃度CpcBNo對(duì)羥基自由基的清除能力分別為56%、76%、83%、88%和93%。在各種蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下，CpcBNo對(duì)羥基自由基的清除率均顯著高于CpcBSp;在100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml的質(zhì)量濃度下，CpcBSp和CpcBMa對(duì)羥基自由基的清除率無(wú)顯著差異;在50μg/ml和250μg/ml的質(zhì)量濃度下，CpcBMa對(duì)羥基自由基的清除能力顯著高于CpcBsp。重組蛋白對(duì)羥基自由基的清除能力都高于對(duì)照甘露醇。

3 討論

藻藍(lán)蛋白具有抗氧化性，可以直接從藍(lán)細(xì)菌中提取。由于分子克隆技術(shù)的運(yùn)用和藻藍(lán)蛋白生物合成機(jī)制的解析，藻藍(lán)蛋白也能重組產(chǎn)生，且表現(xiàn)出更好的抗氧化效應(yīng)。從大腸桿菌中提取蛋白質(zhì)比從藍(lán)藻中提取更為簡(jiǎn)單，故重組藻藍(lán)蛋白引起廣泛關(guān)注。藻藍(lán)蛋白的抗氧化性不僅與色素有關(guān)，也有脫輔基蛋白的貢獻(xiàn)。利用脫輔基蛋白的抗氧化能力可以避免復(fù)雜的色素蛋白合成過(guò)程，提高重組的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)產(chǎn)量。本研究中，我們?cè)诖竽c桿菌中重組3種藍(lán)細(xì)菌藻藍(lán)蛋白β亞基的脫輔基蛋白并評(píng)估其抗氧化能力。結(jié)果表明，3種藻藍(lán)蛋白對(duì)羥基自由基的清除效率均與質(zhì)量濃度有關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度為100μ/ml時(shí)，CpcBNo、CpcBMa和CpcBsp對(duì)羥基自由基的清除率均已超過(guò)50%，分別為76%、72%和71%，三者較為接近，它們

重組蛋白對(duì)DPPH自由基的清除能力也隨著重組蛋白濃度的升高而逐步提高（圖5）。重組蛋白質(zhì)量濃度為50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml時(shí)，CpcBSp對(duì)DPPH自由基的清除能力分別為3%、11%、20%、27%和43%，CpcBMa對(duì)DPPH自由基的清除能力分別為7%、14%、25%、37%和49%，CpcB No對(duì)DPPH自由基的清除能力分別為8%、15%、26%、40%和58%。在較高濃度（250μg/ml）時(shí)，CpcBNo明顯比CpcBMa和CpcBSp具有更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，但是它們的清除能力都低于對(duì)照抗壞血酸。3種重組蛋白對(duì)羥基自由基的清除能力比對(duì)DPPH自由基的清除能力都要強(qiáng)。的蛋白質(zhì)氨基酸序列有高達(dá)79%的同源性。Cherd-kiatikul等也報(bào)道鈍頂螺旋藻CpcB的抗氧化性，樣品質(zhì)量濃度為100μg/ml時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率未超過(guò)50%。這種差異可能并不完全反映其抗氧化能力的差異，也有試驗(yàn)過(guò)程的原因，但對(duì)照甘露醇對(duì)羥基自由基清除率與先前的報(bào)道基本一致。3種重組蛋白中CpcBNa。的羥基自由基清除率最高?；诎被嵝蛄械脑诰€預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)結(jié)果顯不，CpcBNo的水溶性參數(shù)高于CpcBMa和CpcBSp，它們的水溶性參數(shù)分別為47%、35%和33%，這是造成它們抗氧化性差異的原因之一，但也有可能是其抗氧化活性位點(diǎn)并未完全處在保守性區(qū)域，其分布表現(xiàn)同質(zhì)性。藻藍(lán)蛋白對(duì)DPPH自由基的清除率比對(duì)羥基自由基的清除率要低得多。質(zhì)量濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，CpcB No、Cpc BMa和CpcBsp對(duì)DPPH自由基的清除率均未超過(guò)15%，分別為15%、14%和11%。但對(duì)DPPH自由基清除能力仍表現(xiàn)為CpcBNo>CpcBMa> CpcBsp，其趨勢(shì)與對(duì)羥基自由基清除能力一致。這也再次說(shuō)明魚腥藻CpcB具有較好的抗氧化潛力。

總之.3種重組蛋白具有顯著的抗氧化潛力，可以開發(fā)為抗氧化試劑。不同藍(lán)藻的重組藻藍(lán)蛋白的抗氧化性較為接近，這歸因于它們的氨基酸序列具有較高的同源性。重組藻藍(lán)蛋白抗氧化性也存在一定差異，這表明通過(guò)選擇不同藍(lán)細(xì)菌藻藍(lán)蛋白是提高重組藻藍(lán)蛋白抗氧化能力的有效途徑。藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白的抗氧化機(jī)理還需更多的研究證實(shí)。研究不同藻種的藻藍(lán)蛋白抗氧化能力及其差異是研究其抗氧化機(jī)制的重要途徑。也可以通過(guò)蛋白質(zhì)遺傳改造的方式提高藻藍(lán)蛋白的抗氧化活性，為藻藍(lán)蛋白在食品加工和醫(yī)療上的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。