九香蟲及其偽品小皺蝽對人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制比較

吳有芳 曹米蘭 檀軍 郭建軍

摘要：小皺蝽為九香蟲的偽品，市場上常被作為九香蟲銷售。本實驗旨在用MTT法檢測九香蟲和小皺蝽血淋巴對人胃癌SGC-7901細胞的增長抑制作用，比較二者對人胃癌SGC-7901細胞的體外增殖抑制作用。用九香蟲和小皺蝽血淋巴分別作用于體外培養(yǎng)的SGC-7901細胞，測定其抑制率。結(jié)果表明，九香蟲和小皺蝽對SGC-7901細胞皆有抑制作用，且抑制率隨時間和濃度的增加而增加;相同濃度不同時間（24 h、48 h、72 h）和相同時間不同濃度（100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L）小皺蝽對SGC-7901細胞的抑制率皆高于九香蟲。

關(guān)鍵詞：九香蟲;小皺蝽;人胃癌細胞SGC-7901細胞;抑制率;MTT法

Comparison of the Inhibitory Effects between Aspongopus chinensis and Cyclopelta parva on Proliferation of Human Gastric Cancer Cell SGC-7901

WU You?fang，CAO Mi?lan，TAN Jun， GUO Jian?jun*

（Institute of Entomology， Guizhou ?Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Region， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China）

Abstract：Cyclopelta parva is a counterfeit species of Aspongopus chinensis， which usually be sold as A.?chinensis in the market.?This paper ?aimed to clarify the inhibitory effect of C.?parva on the proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells in vitro by comparing their inhibitory effects on human gastric cancer cell SGC-7901 with A.?chinensis by MTT method.?The results demonstrated that the inhibition rates of SGC-7901 treated by A.?chinensis and C.?parva heamolymph both increased with times and concentrations.?C.?parva haemolymph had higher inhibitory effects on SGC-7901 than A.?chinensis regardless of the same concentration with different times or different concentrations with the same time.

Key words：Aspongopus chinensis; Cyclopelta parva; SGC?7901; inhibition rate; MTT method

九香蟲Aspongopus chinensis Dallas，1851隸屬于昆蟲綱Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae[1]，是傳統(tǒng)的藥用資源昆蟲，主治膈脘滯氣、脾腎虧損、壯元陽、胃寒脹、腰膝酸痛[2-3]?，F(xiàn)代藥理學研究表明九香蟲對胃癌、乳腺癌均有一定的療效，以九香蟲為原料的一些中成藥，如復方香龍散、九香抗癌定痛散等對抑制癌細胞都有一定的作用。九香蟲血淋巴提取物對胃癌和乳腺癌體外細胞增殖具有一定的抑制作用[4-6]。小皺蝽Cyclopelta parva Distant隸屬于昆蟲綱Insecta半翅目Hemiptera蝽科Pentatomidae[7]。小皺蝽和九香蟲外形較為相似，在市場上常被當成九香蟲廣泛出售，又被稱為“小九香蟲”。但是其是否具有抑制胃癌細胞增殖的功效尚不清楚。目前國內(nèi)外還未出現(xiàn)過與小皺蝽抑制癌細胞相關(guān)的研究報道。所以本實驗研究小皺蝽和九香蟲對胃癌細胞的抑制作用比較，明確小皺蝽是否具有抑制胃癌細胞的作用及與九香蟲的差異。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試蟲源

九香蟲成蟲采集自貴州省習水縣習酒鎮(zhèn)河灘上，習酒鎮(zhèn)地處北緯28°09′，東經(jīng)106°10′。

小皺蝽成蟲采集自貴州省貴陽市花溪區(qū)田園北路刺槐，花溪區(qū)地處北緯26°11′～26°34′，東經(jīng)106°27′～106°52′。

上述采集獲得的活蟲置于-80℃冰箱（美國Thermo公司）冷凍備用。

1.1.2主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（美國HyClone公司），二辛可酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（北京康為世紀公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Amresco公司），胰蛋白酶（美國賽默飛世爾科技有限公司），噻唑藍（MTT，美國Sigma公司）。

1.2方法

1.2.1九香蟲和小皺蝽血淋巴制備

九香蟲和小皺蝽血淋巴制備參照楊佳琪等 [6] 的方法。

1.2.2九香蟲和小皺蝽蛋白濃度測定

利用BCA法測定九香蟲和小皺蝽的蛋白濃度。參照BCA蛋白定量試劑盒說明書制作標準曲線，將九香蟲和小皺蝽的血淋巴稀釋100倍加入酶標孔板中，每孔25 μL，設(shè)置三個重復孔，每孔加入200 μL已配制好的BCA工作液。放入37℃環(huán)境下，孵育30 min。冷卻至室溫，在562 nm波長檢測吸光度（OD）值。根據(jù)標準曲線計算九香蟲和小皺蝽總蛋白濃度。

1.2.3SGC-7901細胞培養(yǎng)

人胃癌SGC-7901細胞購自中科院上海細胞庫，用含10%胎牛血清，1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.4MMT法檢測九香蟲和小皺蝽對SGC-7901細胞的抑制率

實驗設(shè)有實驗組，無藥對照組和空白對照組。

將培養(yǎng)到對數(shù)期的SGC-7901細胞用0.25%的胰酶消化，用DMEM培養(yǎng)液稀釋，使細胞密度達到1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，接種3塊96孔板。置于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，吸盡原培養(yǎng)液，分別加入含100 mg/L，200 mg/L，300 mg/L，400 mg/L九香蟲和小皺蝽血淋巴的DMEM培養(yǎng)液，對照組加入不含血淋巴的DMEM培養(yǎng)液;每個處理5個復孔。置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24 h，48 h，72 h后各取出1塊96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩20 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后在570 nm波長下，用酶標儀檢測吸光度（OD）值。

計算細胞增殖抑制率：

抑制率=[1-（實驗組OD值-空白組OD值）/（無藥對照組OD值-空白對照組OD值）]×100%

1.3數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行單因素方差ANOVA分析。試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準誤（x±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義;采用Excel軟件繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1BCA法測定九香蟲和小皺蝽蛋白含量

應(yīng)用BCA法測得各濃度標準牛血清蛋白吸光度值，計算平均值（表1）。

以吸光度為橫坐標（X），濃度為縱坐標（Y）進行線性回歸分析，得到蛋白質(zhì)的標準線（圖1）：Y=0.9609X-0.0607，R2=0.9887。

根據(jù)標準曲線和測得的九香蟲和小皺蝽血淋巴稀釋液的吸光度值計算蛋白質(zhì)濃度，得到小皺蝽血淋巴液蛋白濃度比九香蟲血淋巴液的蛋白濃度低（見表2）。

2.2九香蟲和小皺蝽血淋巴對SGC-7901細胞抑制率的比較

根據(jù)BCA蛋白測定法確定的九香蟲和小皺蝽血淋巴的蛋白含量，計算用于SGC-7901細胞的九香蟲和小皺蝽的血淋巴濃度分別為100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L。MTT法檢測結(jié)果（見表3），血淋巴處理24 h、48 h、72 h后，九香蟲和小皺蝽對SGC-7901細胞增殖都有明顯抑制作用。相同時間不同濃度下九香蟲和小皺蝽血淋巴對SGC-7901細胞的抑制率與無藥對照組比較，有顯著差異（P<0.05）。相同時間不同濃度下九香蟲和小皺蝽對SGC-7901細胞抑制率比較，有顯著差異（P<0.05）。

實驗結(jié)果顯示（圖2），相同時間不同濃度下，九香蟲和小皺蝽血淋巴對SGC-7901細胞的抑制率隨濃度的增加而增加，且小皺蝽血淋巴對SGC-7901的抑制作用比九香蟲血淋巴的明顯。相同濃度不同時間下，九香蟲和小皺蝽血淋巴對SGC-7901細胞的抑制率隨時間的增加而增加。處理SGC-7901細胞24 h后，在試驗的任何濃度下，小皺蝽血淋巴對SGC-7901細胞的抑制作用比九香蟲血淋巴明顯，最高抑制率為400 mg/L時，抑制率達到64.13%。處理48 h后，小皺蝽對SGC-7901細胞的抑制作用在實驗的任何濃度下同樣比九香蟲高，抑制率最高是400 mg/L時，小皺蝽為91.44%，九香蟲為80.48%。血淋巴處理72 h后，小皺蝽血淋巴對SGC-7901細胞的抑制作用同樣比九香蟲好，在400 mg/L時，抑制率最高，達到了99.06%。處理72 h后，九香蟲和小皺蝽血淋巴對SGC-7901的抑制率都比較高，但相同濃度下，小皺蝽對SGC-7901的抑制率同樣高于九香蟲。

3結(jié)論與討論

九香蟲作為傳統(tǒng)藥用昆蟲，除了本草綱目中有所記載，在《動物藥》也載錄了九香蟲可與多種中藥治療肝胃氣痛、十二指腸潰瘍、胃炎和血管瘤等多種疾病[8]，且九香蟲的蛋白提取物對SGC-7901細胞有明顯的增殖抑制作用[9]。并在臨床上得到應(yīng)用，具有重要的藥用價值。在市場上小皺蝽常作為九香蟲售賣，但對于小皺蝽藥用價值研究報道的比較少。目前，國內(nèi)外還沒有對小皺蝽抗癌方面的研究進行報道。所以研究探討小皺蝽是否具有抗癌活性以及其抗癌活性的高低對開發(fā)有藥用價值的昆蟲，發(fā)掘更多抗腫瘤藥用昆蟲有著重要的意義。

本研究顯示，九香蟲對SGC-7901細胞的抑制作用隨時間和濃度的增加而增加，有較好抑制體外SGC-7901細胞增殖的作用，這與檀軍等 [5] 的研究結(jié)果一致。小皺蝽雖然作為九香蟲偽品，但其血淋巴對人胃癌SGC-7901細胞有明顯的抑制作用。在用九香蟲和小皺蝽血淋巴分別作用SGC-7901細胞24 h和48 h后，小皺蝽對SGC-7901細胞的增殖抑制作用明顯高于九香蟲;特別是處理24 h后，小皺蝽對SGC-7901細胞的抑制作用顯著高于九香蟲;在處理72 h后，小皺蝽和九香蟲對SGC-7901細胞的增殖都有較明顯的抑制作用，但小皺蝽對SGC-7901細胞的抑制率依然高于九香蟲。小皺蝽與九香蟲對SGC-7901細胞增殖抑制差異可能是九香蟲和小皺蝽的作用物質(zhì)或作用機制不同導致小皺蝽在較短的時間就對SGC-7901細胞有比九香蟲高的抑制率;這還需要進一步進行研究驗證。從本研究可以確定的是小皺蝽對SGC-7901細胞的增殖抑制作用高于九香蟲。

小皺蝽前期研究也已證明其具有良好的抗菌活性[10-11];該結(jié)果與九香蟲前期研究相吻合[12]。因而初步推測小皺蝽和九香蟲相似，都可以作為藥用資源昆蟲，且具有類似的抗菌、消炎、誘導癌細胞凋亡及增強機體免疫力功效。

盡管小皺蝽已經(jīng)明確其具有類似九香蟲的藥物功效，但是九香蟲的活性物質(zhì)已經(jīng)初步明確為功能多肽（實驗室發(fā)表中），作用途徑為內(nèi)源線粒體凋亡途徑[13]。小皺蝽的抑制癌細胞活性物質(zhì)、作用途徑、作用機制等是否和九香蟲一致或類似，仍未可知，仍需進一步明確。并且除了對小皺蝽抗菌活性和抑制癌細胞增殖的作用有過研究，其他領(lǐng)域還沒有過多的研究，因此還需要對小皺蝽進行更多方面的研究來確定其是否真的如九香蟲一樣具有良好的藥用價值。因而小皺蝽作為九香蟲替代品的合理性也仍需進一步研究和探討。

相信上述問題的明確可以為小皺蝽這一新提出的藥用資源昆蟲[7]的開發(fā)利用奠定堅實的應(yīng)用基礎(chǔ)。

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