香玲核桃組培褐化控制的研究

何九軍 趙淑玲 朱迎春 張少飛

摘要 通過組織培養(yǎng)香玲核桃，對其滅菌方法、褐變、培養(yǎng)基選擇、培養(yǎng)條件、組織培養(yǎng)苗生根技術(shù)等方面進(jìn)行了探討和研究。

關(guān)鍵詞 香玲核桃；組織培養(yǎng)；營養(yǎng)價(jià)值；褐化

中圖分類號：Q813.1+2；S664.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-3305（2018）05-010-02

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.05.005

組織培養(yǎng)在植物離體快繁、無病毒苗木培育，遺傳育種及種質(zhì)資源保存等方面取得了許多成就和進(jìn)展。然而，在植物的組織培養(yǎng)中易出現(xiàn)外植體或培養(yǎng)物的褐化、枯死現(xiàn)象[1]。褐變是由組織中的酚類物質(zhì)經(jīng)多酚氧化酶（PPO）氧化后產(chǎn)生棕褐色的醌類物質(zhì)所造成的[2]。

核桃自古以來深受隴南廣大農(nóng)民喜愛，經(jīng)濟(jì)效益尤被看好。作為食療佳果，核桃含有大量脂肪和易被人體吸收的蛋白質(zhì)，其所含蛋白質(zhì)中有對人體極為重要的賴氨酸，對大腦神經(jīng)十分有益。中醫(yī)認(rèn)為核桃可溫肝、補(bǔ)腎、健腦、強(qiáng)筋、壯骨，還能治療性功能減退、神經(jīng)衰弱、記憶衰退、潤腸通便、腎結(jié)石，有防癌、防心腦血管疾病、防輻射、抗衰老等作用。文中通過組織培養(yǎng)香玲核桃，就其滅菌方法、褐變、培養(yǎng)基選擇、培養(yǎng)條件、組織培養(yǎng)苗生根技術(shù)等方面進(jìn)行了探究。

1 材料與方法

1.1 材料

材料：香玲核桃在甘肅成縣核桃科技示范園采集。

儀器：燒杯，天平，滅菌培養(yǎng)皿，外植體剪刀，濾紙，酒精燈，計(jì)時(shí)器，紗布，托盤，錐形瓶（3個(gè)），廢液罐（3個(gè)），一次性手套，玻璃棒，鑷子；超凈工作臺（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），LDZX？鄄50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

試劑：無菌水，升汞，酒精（75%），注射用青霉素鈉（哈藥集團(tuán)），蔗糖（天津市永大化學(xué)試劑有限公司），PVP 聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂粉，抗壞血酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠），6？鄄BA，I？鄄BA，I？鄄AA。

1.2 方法

1.2.1 核桃外植體的處理 ①先用紗布包裹外植體，用流水沖洗30 min；②用浸有酒精（75%）的紗布輕輕擦拭初步消毒；③用植體剪裁剪外植體，除去植體兩端，將有分叉的枝干裁剪至約2～3 cm長，平均放入3個(gè)錐形瓶中；④用75%酒精消毒30 s，需搖晃錐形瓶，以保證消毒徹底。消毒后放入指定的廢液酒精罐中；⑤用升汞分別消毒5、7、10 min。用計(jì)時(shí)器準(zhǔn)確記錄時(shí)間。消毒同須搖晃錐形瓶，以起到徹底消毒的作用。消毒后將廢液升汞倒入指定的廢液罐中；⑥用無菌水沖洗3～5次。沖洗需要徹底搖晃，達(dá)到徹底清洗消毒液的作用。將廢水倒入指定的廢水罐中；⑦將無菌的濾紙?jiān)诰凭珶羯献茻?，平鋪于培養(yǎng)皿底部，兩外植體依次按5、7、10 min吸干多余水分，進(jìn)行接種，并且標(biāo)記。

1.2.2 核桃外植體的接種 在超凈工作臺上，用250 mg/L的PVP浸泡消毒后的外植體5 min，用無菌紗布擦干表面水分；打開培養(yǎng)基，用無菌鑷子和剪刀將外植體剪切成帶芽的莖端（1.5～2.5 cm），置于培養(yǎng)基中，將外植體與培養(yǎng)基平面成45°角斜插入培養(yǎng)基中（芽尖向上）；瓶口火焰消毒后，蓋上瓶塞，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。7 d后開始觀察。

1.2.3 核桃外植體的培養(yǎng)條件 光照條件12 h/d，光照強(qiáng)度2 000-2 500 LX，溫度25/18℃。

1.3 試驗(yàn)過程

稱取瓊脂12 g，蔗糖50 g，將其加入盛有500 ml的大盆中，放到電爐上加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，按表1配置基本培養(yǎng)基（DKW）并加入相應(yīng)激素，再將其加入裝有300～400 ml蒸餾水的燒杯中，待瓊脂完全溶解后，倒入大盆中，繼續(xù)攪拌，調(diào)pH后，再將盆中的物質(zhì)倒入前期準(zhǔn)備好的錐形瓶中，蓋上塞子，分別標(biāo)記為H1、H5與H6。獲得H1，H5，H6各30瓶。

2 結(jié)果與分析

從表2可以看出，H1、H5和H6 3種培養(yǎng)基中，H6的培養(yǎng)基中的核桃苗的褐變數(shù)最少，故H6（改良的DKW+6？鄄BA 10 g/L+I？鄄AA 50 g/L+PVP+抗生素）的培養(yǎng)基效果最好。

3 結(jié)論與討論

褐化現(xiàn)象是果樹組織培養(yǎng)中的普遍現(xiàn)象，桃、 杏、 櫻桃、 李等均有關(guān)于褐變的報(bào)道，核桃的褐化表現(xiàn)更為明顯。褐化是由于酚類物質(zhì)被氧化成醌，醌聚合后形成深色物質(zhì)而產(chǎn)生的。培養(yǎng)材料的種類與品種、 外植體材料的生理狀態(tài)、營養(yǎng)狀況、生長部位等是內(nèi)因，培養(yǎng)基成分、添加激素的種類和濃度、培養(yǎng)條件等為外因，均會導(dǎo)致褐變的產(chǎn)生。在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑或酚類吸附劑是防止外植體褐變的常用方法，對于減少香玲核桃的褐變還有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 趙寶軍，宮永紅. 遼寧省核桃優(yōu)良品種及主要栽培技術(shù)[J].遼寧林業(yè)科技，2002（4）：40-41.

[2] 姚紅軍，羅曉芳，田硯亭. 植物組織培養(yǎng)褐變的研究進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21（3）：78-84.

[3] 劉淑蘭. ‘薄殼香核桃組培中的褐化及防止措施研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2009，29（2）：171-172.

[4] 張小紅，代侃韌，馬兆平，等. 核桃離體培養(yǎng)中外植體褐化的研究[J]. 陜西林業(yè)科技，2005（5）：7-9.

[5] 張建成. 吳國良. 屈紅征，等. 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對核桃試管芽苗繼代增殖的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（1）：45-48.

[6] 江虎軍， 潘季淑， 孟新法. 桃莖尖培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1993，19（1）：49-52.

[7] 馬鋒旺，張軍科，李嘉瑞.杏離體繁殖的研究[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1999， 27（4）：12-15.

[8] 鄒英寧，李國懷，樊青峰，等.等不同抗氧化劑對中國李莖段培養(yǎng)的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2006， 25（1） ：84-86.

責(zé)任編輯：劉赟