牛蒡子苷元對子宮內(nèi)膜癌HEC1B細(xì)胞的增殖抑制作用及機(jī)制

劉若男　劉文靜　邱建閣

摘要目的：探討牛蒡子苷元（ARG）對子宮內(nèi)膜癌HEC1B細(xì)胞的增殖抑制作用及機(jī)制。方法：HEC1B細(xì)胞分為觀察組和對照組，觀察組用終濃度為10、20、30、40、60、100 μmol/L的ARG干預(yù)，對照組用05%二甲基亞砜（DMSO）干預(yù)。48 h后，用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測胞增殖情況；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期；蛋白免疫印跡法（WB）檢測細(xì)胞NFκB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：10、20、30、40、60、100 μmol/L ARG干預(yù)48 h，HEC1B細(xì)胞的相對生存率分別為（9236±052）%、（8959±074）%、（7849±068）%、（5647±059）%、（4012±069）%、（3752±058）%，且隨著ARG作用濃度的升高，HEC1B細(xì)胞的相對生存率呈逐漸降低趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），干預(yù)48 h HEC1B細(xì)胞50%抑制濃度（IC50）為50 μmol/L。對照組和觀察組（50 μmol/L ARG）細(xì)胞凋亡率分別為（289±056）%、（2658±326）%，觀察組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。但觀察組細(xì)胞周期分布與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。觀察組（50 μmol/L ARG）細(xì)胞p65、pIκBα蛋白表達(dá)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），2組間IκBα蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。結(jié)論：ARG可抑制HEC1B細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制與可能與降低NFκB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平，抑制NFκB通路活化有關(guān)。

關(guān)鍵詞子宮內(nèi)膜癌；牛蒡子苷元；HEC1B細(xì)胞；增殖；凋亡；NFκB通路

Proliferation Inhibition Effect of Arctigenin on Endometrial Carcinoma HEC1B Cell and Its Mechanism

Liu Ruonan1，Liu Wenjing1，Qiu Jiange2，Luo Suiyu3

（1 Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450008，China； 2 Cell Signal Transduction and Proteomics Research Center，The Academy of Medical Science，ChinaZhengzhou University，Zhengzhou 450008，China； 3 Department of Gynecology，Henan Province People′s Hospital，Zhengzhou 450003，China）

AbstractObjective：To investigate the proliferation inhibition effect of Arctigenin （ARG） on endometrial carcinoma HEC1B cell and its mechanism.Methods：HEC1B cells were divided into test group and control group.The test group was intervened with ARG at the final concentration of 10，20，30，40，60，100 μmol/L，and the control group was intervened with 05% dimethyl sulfoxide （DMSO）48 h after incubation，the proliferation was detected by MTT assay.The cell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry.The expression of NFκB signaling pathway related proteins were detected by western blotting （WB）.Results：The relative survival rates of HEC1B cell intervened with 10，20，30，40，60 and 100 mol/LARG after 48 h were （9236±052）%，（8959±074）%，（7849±068）%，（5647±059）%，（4012±069）%，（3752±058）% respectively，with the increase of ARG concentration.The relative survival rates of HEC1B cells decreased gradually （P<005）50% inhibitory concentration （ID50） of HEC1B cells intervened with ARG after 48 h was 50 μmol/L.The apoptosis rates of HEC1B cells in the control group and the test group （50 μmol/L ARG） were （289±056）%，（2658±326）% respectively.The apoptosis rate in the test group was significantly higher than that in the control group （P<005）.However，there was no significant difference in cell cycle distribution between the test group and the control group （P>005）.The expression levels of p65 and pIκBα in the test group （50 μmol/L ARG） were significantly lower than that in the control group （P<005）.There was no significant difference in the expression levels of IκBα between the test group and the control group （P>005）.Conclusion：ARG can inhibit the proliferation and promote apoptosis of HEC1B cells，and its mechanism may be related to decreasing the expression level of NFκB related protein and inhibiting the activation of NFκB pathway.

Key WordsEndometrial carcinoma； Arctigenin； HEC1B cells； Proliferation； Apoptosis； NFκB pathway

中圖分類號：R2855文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.046

子宮內(nèi)膜癌又稱子宮體癌，為子宮內(nèi)膜腺體的惡性腫瘤，約占女性癌癥總數(shù)的7%，其發(fā)病與遺傳、患者長期使用激素以及高血壓、肥胖、糖尿病、不孕不育、絕經(jīng)等體質(zhì)因素有關(guān)[12]。近年來中西醫(yī)結(jié)合抗腫瘤治療取得了較為顯著的臨床效果，因此中藥及其活性成分的抗腫瘤作用研究成為廣大中醫(yī)醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注的焦點(diǎn)，也成為臨床研究的熱點(diǎn)和方向。牛蒡子苷元（Arctigenin，ARG）為木質(zhì)素類化合物，是中藥牛蒡子的主要藥理活性成分之一[3]。最新研究[45]證實(shí)，ARG不僅具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)的功效，還具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，體外實(shí)驗(yàn)顯示ARG能夠增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，但是目前其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞抗腫瘤作用的研究仍較為罕見。本研究以子宮內(nèi)膜癌HEC1B細(xì)胞為研究模型，觀察ARG對HEC1B細(xì)胞的增殖抑制作用，分析其抗腫瘤作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

11材料

111細(xì)胞子宮內(nèi)膜癌HEC1B細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

112藥品ARG：每支20 mg，批號：115711，美國Santacruz Biotechology公司；DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma公司；胎牛血清，美國Gibco公司；胰蛋白酶，杭州四季青生物試劑有限公司；Annexin VFITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，美國Thermofisher有限公司；p65和IκBα抗體，美國Santa Cruz公司；磷酸化IκBα（pIκBα）抗體，美國Cell Signaling公司等。

113儀器細(xì)胞培養(yǎng)板及細(xì)胞培養(yǎng)瓶，無錫耐思生物科技有限公司；DS425P電子天平，上海寺崗電子有限公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter有限公司；CKX31熒光倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司；725型紫外可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；MetaMorph圖像分析系統(tǒng)，美國Media Cybernetics公司等。

12方法

121ARG的配制DMSO溶解ARG制成20 mmol/L的溶液，除菌后4 ℃避光暫存。

122HEC1B細(xì)胞培養(yǎng)及ARG干預(yù)將HEC1B細(xì)胞以含有10%胎牛血清、1×105 U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于溫度為37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天以025%的胰蛋白酶消化傳代1次。將生長至對數(shù)期HEC1B細(xì)胞用025%胰蛋白酶消化，PBS洗滌后，以DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×104～3×104個/mL接種于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，觀察組細(xì)胞分別加入終濃度為10、20、30、40、60、100 μmol/L的ARG處理[6]，對照組則以05%DMSO處理，各組均繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

13觀察指標(biāo)

131MTT法檢測ARG對HEC1B細(xì)胞增殖抑制作用取上述處理48 h后的HEC1B細(xì)胞，用025%胰蛋白酶消化，以密度為4×103～5×103個/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后待細(xì)胞貼壁生長后，按照122的方法處理細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)胞增殖活性的檢測。將各組細(xì)胞上清吸棄后加5 mg/mL的MTT，每孔20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加DMSO，輕輕震蕩10 min，以全自動酶標(biāo)儀檢測各孔于波長為570 nm的吸光光度值（OD570 nm），繪制生存曲線，細(xì)胞相對生存率=（觀察組OD570 nm/對照組OD570 nm）×100%，計(jì)算50%抑制濃度（IC50）。

132流式細(xì)胞術(shù)檢測ARG對HEC1B細(xì)胞周期及凋亡率的影響觀察組和對照組HEC1B細(xì)胞分別用50 μmol/L的ARG及05%DMSO處理，干預(yù)48 h后，按照Annexin VFITC/PI檢測試劑盒的實(shí)驗(yàn)要求收集細(xì)胞并處理，于收集好的細(xì)胞沉淀中加入1×binding buffer 200 μL懸浮細(xì)胞，并加入Annexin VFITC 5 μL，4 ℃避光孵育15 min，加5 μL碘化丙啶（PI）染液混勻，室溫避光孵育5 min，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，以Modfit LT20細(xì)胞周期分析軟件分析HEC1B細(xì)胞周期分布及凋亡情況。

133蛋白免疫印跡法（WB）檢測ARG對HEC1B細(xì)胞NFκB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響將HEC1B細(xì)胞以密度為2×104～3×104個/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，至對數(shù)期棄培養(yǎng)液，觀察組分別加終濃度為50 μmol/L的ARG處理，對照組則以05%DMSO處理，48 h后收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白，以βactin為參照，MetaMorph圖像分析系統(tǒng)分析各組細(xì)胞p65、IκBα、pIκBα蛋白表達(dá)情況。

14統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 220軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNKq檢驗(yàn)法，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21ARG對HEC1B細(xì)胞的增殖抑制作用經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)檢測，10、20、30、40、60、100 μmol/L ARG處理48 h，HEC1B細(xì)胞的相對生存率分別為（9236±052）%、（8959±074）%、（7849±068）%、（5647±059）%、（4012±069）%、（3752±058）%，隨著ARG作用濃度的升高，HEC1B細(xì)胞的相對生存率呈逐漸降低趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），ARG處理48 h HEC1B細(xì)胞的ID50為50 μmol/L，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用50 μmol/L的ARG進(jìn)行HEC1B細(xì)胞的處理。

3討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率居我國婦科腫瘤的第2位，而近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢，嚴(yán)重危害女性健康。常規(guī)放化療雖可抑制癌細(xì)胞增殖，但患者對于小劑量治療易產(chǎn)生耐藥性，大劑量治療則由于其細(xì)胞毒性，患者易無法耐受而影響臨床治療，因而更安全有效的低毒性治療藥物成為臨床研究的熱點(diǎn)和方向。中醫(yī)學(xué)中并無子宮內(nèi)膜腺癌的病名，據(jù)其主要臨床特點(diǎn)將其歸屬“崩漏”“痛經(jīng)”“癥瘕”“五色帶下”等范疇，認(rèn)為正氣虛弱、血瘀、氣滯、濕毒、熱邪等為子宮內(nèi)膜腺癌的主要病機(jī)，屬于本虛標(biāo)實(shí)之癥?；颊呒膊〕跗谛笆⒍撁黠@，后期則隨疾病病情進(jìn)展出現(xiàn)氣血陰陽虛弱，表現(xiàn)為肝脾腎三臟具損，而腎虛腎臟受損最甚[7]。尚洪宇[8]研究認(rèn)為，長期肝腎虧虛、沖任二脈失調(diào)導(dǎo)致了子宮內(nèi)膜癌的形成，同時也與脾虛生濕，濕蘊(yùn)化熱，濕熱注于胞宮，與癒血互結(jié)化為邪毒所致有關(guān)。目前關(guān)于中醫(yī)藥抗腫瘤的相關(guān)研究報(bào)道甚多，充分反映出中藥所具有的潛在抗腫瘤作用，李柳葉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草黃酮通過降低子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。陳寒露等[10]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過上調(diào)抑制基因NKD2的表達(dá)，抑制Wnt信號通路進(jìn)而體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的生長。武超等[11]研究表明，黃芪皂苷Ⅱ可增加人肝癌細(xì)胞株HepG2對5FU的敏感性，明顯抑制細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與抑制pERK1/2表達(dá)有關(guān)。

牛蒡子為牛蒡的果實(shí)，ARG為牛蒡子的主要木脂素成分，具有不良反應(yīng)小及較好的調(diào)控免疫等作用。近期報(bào)道[12]顯示，ARG具有顯著的抗腫瘤活性，其在體內(nèi)外均可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究[13]報(bào)道，ARG可增加非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞對順鉑的敏感性，抑制細(xì)胞增殖；王靜泓等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ARG可促進(jìn)肝癌HepG2、Hep3B細(xì)胞的凋亡，與抑制PI3K/Akt信號通路下調(diào)抗凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ARG可抑制子宮內(nèi)膜癌HEC1B細(xì)胞增殖，并呈濃度依賴性的特點(diǎn)，同時ARG也具有促進(jìn)HEC1B細(xì)胞凋亡的作用，但對細(xì)胞周期并無明顯的影響。因此可以認(rèn)為ARG可能通過誘導(dǎo)HEC1B細(xì)胞凋亡的方式實(shí)現(xiàn)其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的殺傷作用。關(guān)于ARG的抗腫瘤作用機(jī)制研究報(bào)道不一，Huang等[15]發(fā)現(xiàn)，ARG誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡與i NOS/NO/STAT3/Survivin信號通路相關(guān)；Yao等[16]研究證實(shí)，ARG通過抑制STAT3信號增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞體外對順鉑的化療敏感性；Hsieh等[17]報(bào)道，ARG誘導(dǎo)雌激素受體陰性的乳腺癌細(xì)胞凋亡與ROS/p38 MAPK通路有關(guān)。NFκB信號通路為炎性細(xì)胞通路，通過抑制細(xì)胞凋亡、參與腫瘤侵襲性轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)腫瘤耐藥等多種途徑參與腫瘤的形成的進(jìn)展，p65是NFκB通路上的主要位點(diǎn)蛋白，具有調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，激活細(xì)胞因子的級聯(lián)放大作用，可反映NFκB的活化程度[18]。本研究結(jié)果中，觀察組HEC1B細(xì)胞p65、pIκBα蛋白表達(dá)量明顯低于對照組，表明ARG可抑制上游信號分子IκBα的磷酸化，抑制NFκB信號通路，進(jìn)而抑制子宮膜癌HEC1B細(xì)胞的增殖，并促其凋亡。

綜上所述，ARG可抑制HEC1B細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，其作用機(jī)制與可能與降低NFκB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平，抑制NFκB通路活化有關(guān)，但是否具有其他作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

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（2018-04-16收稿責(zé)任編輯：張文婷）