芽孢桿菌發(fā)酵炮制中藥紅花增強溶血栓藥效研究

吳泊 邵幼姿 薛莉麗 潘雯斕

摘要目的：探討芽孢桿菌發(fā)酵炮制中藥紅花增強溶血栓藥效。方法：采用系統(tǒng)數(shù)值化和數(shù)值系統(tǒng)調(diào)控技術(shù)對發(fā)酵炮制條件進行合理適量優(yōu)化，用角叉菜膠法對小鼠尾部進行了血栓實驗，檢測了大鼠纖溶和凝血指標(biāo)。結(jié)果：在相同劑量下（1 000 U/mL）A紅發(fā)組（紅花與C213共發(fā)酵組）比其余各組有明顯縮短血栓長度（P<005），凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）以及活化的部分凝血活酶時間（APTT）被延長，明顯縮短優(yōu)球蛋白溶解時間（ELT）的作用（P<005）。結(jié)論：紅花通過C213菌種發(fā)酵炮制后可有效提升纖溶活性、抗凝作用，增大溶血栓的藥效。

關(guān)鍵詞芽孢桿菌；發(fā)酵炮制；中藥紅花；增強；溶血栓；抗凝；纖溶活性；藥效

Study on the Efficacy of Bacillus Fermented Chinese Medicine Flos Carthami in Enhancing Thrombolytic Effect

Wu Bo， Shao Youzi， Xue Lili， Pan Wenlan

（Department of Pharmacy， Yixing People′s Hospital， Jiangsu University， Yixing 214200， China）

AbstractObjective：To explore the efficacy of bacillus fermentation processing Chinese medicine Flos Carthami in enhancing thrombolytic effect. Methods：Numerical system and system of numerical control technology were used for reasonable proper optimization of fermentation processing conditions. The carageen glue method was carried out on mice tail thrombosis experiment to test the fibrinolytic and blood coagulation index of rats. Results：Under the same dose （1 000 U/mL）， A red hair group （Flos Carthami and C213 fermentation group） significantly shorten thrombus length than the rest of the groups （P<005）. The effective extension of thrombin time （TT）， prothrombin time （PT） and activated clotting time （APTT） live enzymes were delayed， and significantly shorten euglobulin dissolution time （ELT） effect （P<005）. Conclusion：Flos Carthami by C213 strains fermentation processing after anticoagulant effect， can effectively improve fibrinolytic activity， and increase the efficacy of dissolving thrombus.

Key WordsBacillus； Fermentation processing； Chinese medicine Flos Carthami； Enhanced； Dissolve thrombus； Efficacy

中圖分類號：R2855文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.049

微生物所自有的酶系會影響物質(zhì)轉(zhuǎn)化，但必須是在條件溫和的情況下，生成全新的物質(zhì)。中藥炮制時需在中藥中使用微生物發(fā)酵，有利于藥物藥效的發(fā)揮；利用微生物發(fā)酵可將藥物進行轉(zhuǎn)變，成為更容易被人體吸收的小分子；中藥的有效成分可借助微生物代謝生成全新的藥物，其藥效發(fā)揮更佳。微生物發(fā)酵的次生代謝產(chǎn)物和藥物成分可以發(fā)生協(xié)同作用，這樣可以增強藥效。紅花Carthamus tinctorius L屬于菊科植物紅花中的干燥花，其功效主要是祛瘀止痛、活血通絡(luò)。紅花是一種活血通絡(luò)、去瘀止痛的良藥，屬于菊科植物紅花的干燥花[2]。最近幾年被廣泛用于血行不同，淤血阻滯，另外，紅花對降血脂、抗血栓也十分有療效。本文炮制中藥紅花采用的微生物是一株高纖溶酶活性的地衣芽抱桿菌，對共發(fā)酵條件進行研究，同時進行發(fā)酵產(chǎn)物藥效實驗，明確其的藥效作用。

1材料與方法

11材料

111藥物紅花，產(chǎn)地四川簡陽，經(jīng)過鑒定被歸為菊科植物紅花Carthamus Tinctorius的干燥花。

112動物實驗所需60只SD大鼠均由相關(guān)中藥研究所實驗動物中心提供，體重為240 g左右，差值在20 g以內(nèi)，雌雄各30只。動物飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～29 ℃，日溫差≤3 ℃，相對濕度達40%～70%，新鮮空氣換氣次數(shù)10次/h，氣流速度≤018 m/s，壓差25 Pa，潔凈度1萬級，氨濃度15 mg/m3，噪聲≤60 dB，照度150～300 Lux。飼料應(yīng)無菌、高營養(yǎng)，每次投放3～4 d的飼料，添加熟雞蛋和滅菌葵花籽。）

113菌種本實驗室將地衣芽抱桿菌C213分離后，由中國科學(xué)院某生物研究所環(huán)境研究實驗室鑒定、傳代保存。

114試劑凝血酶（中國藥品生物制品鑒定所，批號：31022822）；凍干人纖維蛋白原（中國藥品生物制品鑒定所，批號：210950031）；角叉菜膠（sigma公司，批號：8001794）；蚓激酶腸溶膠囊（北京百奧藥業(yè)有限公司，批號：20320902）；凝血酶時間，凝血活酶時間，凝血酶原時間，纖維蛋白原試劑盒（太陽診斷系列產(chǎn)品）；其他試劑均為分析純。

12方法

121發(fā)酵操作流程紅花發(fā)酵采用的是生長曲線法，將紅花全花置于40 ℃高溫干燥后粉碎，然后采用200目篩進行過濾，以進一步研究在C213在生長過程中受到紅花的影響程度，對各個培養(yǎng)時間段OD值通過30 nm測量，以此OD值來繪制其生長曲線。C213菌株數(shù)值系統(tǒng)調(diào)控技術(shù)、發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵條件調(diào)控、優(yōu)化采用系統(tǒng)數(shù)值。

122纖溶酶活檢測纖溶酶活的檢測主要是采用Mullertze和Astrop的方法制定標(biāo)準(zhǔn)化的纖維蛋白平板，并將樣品用微量注射器注射于平板上，恒溫保持37 ℃，持續(xù)9 h，之后采用游標(biāo)卡尺對溶斑的垂直直徑進行測量，將溶斑垂直直徑與尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線做比較，得出酶活單位。

123藥效實驗

1231正常大鼠凝血及纖溶指標(biāo)的影響動物分組給藥：每組10只大鼠，5只雌鼠，5只雄鼠，每天按量給每組用藥，每天為大鼠灌胃001 mL/g，并持續(xù)10 d。指標(biāo)觀察以及檢測方法：凝血酶時間（TT）、血酶原時間（PT）、活化的部分凝血活酶時間（APTT）的測定用ACL200全自動血凝儀及其配套產(chǎn)品（美國Coulter公司，型號：ACL200）；優(yōu)球蛋白溶解時間（ELT）測定按藥理實驗方法學(xué)；纖維蛋白原（FIG）的測定用采用Clauss凝固法。

1232小鼠尾部血栓檢測將所有小鼠隨機分配，分為6組，雌鼠、雄鼠各5只，每組公10只小鼠，分別為A對照（磷酸緩沖液002 mol/L），B紅混（將白發(fā)濃縮2倍與25 g/L紅浸等體積混合），C紅發(fā)（C213與紅花一起發(fā)酵加清液1 000 U/mL），D紅浸（紅花水提液25 g/L），E蚓激酶（配置成1 000 U/mL），F(xiàn)白發(fā)（C213發(fā)酵加清液1 000 U/mL），每天為小鼠分別灌胃001 mL/g。持續(xù)3 d后，為小鼠做尾部血栓造型，采用的方法為角叉菜膠法。用藥2 d，之后對血栓出現(xiàn)情況進行觀察，并測量長度。

13統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 220統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料用百分數(shù)（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗。以P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

21發(fā)酵炮制的優(yōu)化將培育基采用數(shù)值系統(tǒng)調(diào)控技術(shù)和系統(tǒng)數(shù)值化進行優(yōu)化和調(diào)控。使用系統(tǒng)數(shù)值化和數(shù)值系統(tǒng)調(diào)控技術(shù)調(diào)控、優(yōu)化了培養(yǎng)基。X1X8為碳源含量（%），X9X22為氮源含量（%），分別是糖蜜、葡萄糖、大豆蛋白陳、玉米蛋白粉等；X23X29為無機鹽含量（%），分別是MgCl2、ZnSO4等，X30X34為發(fā)酵條件，X30表示pH，X31表示裝量（%），X32表示溫度（℃），X33表示接種量（%），X34表示發(fā)酵時間（ h），Y表示發(fā)酵液的酶活（U/mL）。有5項試驗是采用系統(tǒng)因素量的優(yōu)化配置進行的，原系統(tǒng)因素由原來的34個縮減了21個剩13個，試驗結(jié)果見表1共發(fā)酵前。紅花含量0～30（g/L）成為其中的一個因素，也就是說將優(yōu)化后的地衣芽抱桿菌C213和培養(yǎng)基中加入到X35中一起發(fā)酵，以此達到最大優(yōu)化程度提高發(fā)酵條件，結(jié)果見表1共發(fā)酵后。

22紅花劑量對C213生長的影響結(jié)果在0%～5%的不同含量條件下，紅花對C213的生長也會產(chǎn)生不同的影響，或促進或抑制，當(dāng)培養(yǎng)基中的紅花含量為0～30 g/L，可促進地衣芽抱桿菌的生長，當(dāng)紅花含量超出30 g/L，則會抑制其生長，所以在研究過程中對紅花的使用比例要合理。值得關(guān)注的是當(dāng)紅花含量在20～30 g/L，在促進C213生長的同時還延長了其生長期，對微生物作用于紅花有效成分纖維酶的產(chǎn)生和發(fā)酵炮制提供有利條件。

C213菌株發(fā)酵液的酶活性在未添加紅花的情況下僅為665 U/mL，而紅花與C213菌株混合發(fā)酵之后提高了藥效的活性，如表2。這個結(jié)果提示C213菌株的次代謝產(chǎn)物和紅花中的有效成分可相互作用，提高纖維蛋白的溶解效果。

23小鼠尾部血栓抑制為小鼠經(jīng)下皮注射后，小鼠尾部會出現(xiàn)暗紅色血栓，而且暗紅色血栓會逐漸擴大到一定范圍，經(jīng)過一定時間之后，暗紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙?，紫色變?yōu)楹谏驼Ｎ卜纸绶浅Ｃ黠@，結(jié)果見表2。在一樣的水平下，F(xiàn)組明顯可以抑制小鼠尾部血栓的發(fā)生率，而且效果也很好。

24大鼠凝血及纖溶指標(biāo)結(jié)果

241凝血效果比對對凝血酶時間、凝血活酶時間、凝血酶原時間進行測定，反映機體內(nèi)外源性凝血的途徑。如下表中，B，C，D，E，F(xiàn)組和A組作比較，發(fā)現(xiàn)在同等藥劑量下，F(xiàn)組凝血酶時間、凝血活酶時間、凝血酶原時間有效延長，且差異明顯，說明A紅花組對內(nèi)外源性凝血系統(tǒng)有抑制作用，且效果超出其他組。

242纖溶系統(tǒng)影響比較溶栓藥物評定中對藥物溶栓效果通過優(yōu)球蛋白溶解時間、纖維蛋白原反應(yīng)，如表2，A組與其他組進行比較發(fā)現(xiàn)，在同樣藥劑量情況下，F(xiàn)組可有效縮短小鼠血液中優(yōu)球蛋白溶解時間，與其他組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。血漿纖維蛋白原的含量雖然比以前低，但是變化并不明顯，這就表明藥劑量并不影響機體的凝血機制，而且其不良反應(yīng)也小。

3討論

使用微生物技術(shù)發(fā)酵炮制中藥就是將生物進行轉(zhuǎn)化。將微生物生長分泌的胞外酶混入培養(yǎng)基中，作用于培養(yǎng)基中的微生物與中藥發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，也就是說微生物對中藥的發(fā)酵炮制有很好的效果。微生物發(fā)酵炮制中藥的機理就是利用微生物的轉(zhuǎn)化能力。現(xiàn)代發(fā)酵工程證明，微生物具有很多能力，例如氧化、酯化、還原化[5]。所以說，利用微生物發(fā)酵炮制中藥其實就是利用酶催化中藥中的有效成分，并將有效成分改性的生物轉(zhuǎn)化過程。紅花能抗凝血、降血栓的有效成分是其中的紅花醌苷和紅花黃色素，它的作用機理是將其溶解，將人體內(nèi)纖溶酶原激活劑激活，將其激活為纖溶酶，從而起到溶解血栓的作用[6]。紅包中有很多糖苷類化合物，而糖苷類化合物主要是由葡萄糖和酚羥基縮合形成的。當(dāng)糖苷水解酶時就會將這些葡萄糖水解掉，葡萄糖水解掉之后，酚羥基的數(shù)目就會增大，從而提高紅花的抗氧化活性[7]。另外，糖苷化合物水解之后產(chǎn)生的苷元比較容易吸收，生化轉(zhuǎn)化率高，更能發(fā)揮出其的藥理作用。發(fā)酵一方面能夠促使微生物形成各種各樣的此生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物本身就是功效較好的藥物[8]；另外一方面可以根據(jù)微生物中含有的酶定向地轉(zhuǎn)化成為某種藥物，使其的功效朝著預(yù)先的方向發(fā)展，例如已知某種生物中含有某種酶，而含有的這種酶可以將某種化合物結(jié)構(gòu)改變，從而產(chǎn)生新的化合物[9]?；蛘呤前阎兴幹械挠行С煞肿鳛榛A(chǔ)，經(jīng)過微生物代謝產(chǎn)生新的化合物，微生物代謝產(chǎn)生新的化合物和中藥中的成分可以形成新的化合物。微生物在中藥環(huán)境中能夠發(fā)生新的代謝反應(yīng)，這是由于中藥中的某些成分對微生物的代謝和生長有抑制或者是促進作用，以此來改變微生物的代謝途徑，改變代謝途徑后形成新的成分[10]。微生物分解是將中藥中的有毒物質(zhì)分解掉，分解掉之后降低中藥的不良反應(yīng)，另外，微生物的分解作用也可以使中藥中不容易消化吸收的大分子物質(zhì)直接轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，轉(zhuǎn)化成的小分子物質(zhì)非常容易被腸道吸收掉[11]。

利用小鼠尾部血栓實驗對C213紅花發(fā)酵液所含的藥效成分進行測定；用纖維蛋白原和優(yōu)球蛋白溶解時間作為纖溶作用的測定指標(biāo)；測定凝血活酶時間和凝血酶時間等反映機體內(nèi)凝血途徑的情況[12]。紅花組的小鼠尾部血栓長度明顯比其他組的小鼠尾部血栓長度短，降低了FIG的含量，縮短了ELT的時間，延長了PT、TT的數(shù)值，這就說明紅花與C213共發(fā)酵炮制后對機體內(nèi)的內(nèi)外源性凝血體系有很好的抑制作用，纖溶酶得到提高，有效發(fā)揮紅花酵液的溶栓、抗栓作用[13]。

通過分析紅花中的有效成分可得，發(fā)酵炮制后溶栓作用和C213產(chǎn)生的糖普水解酶有關(guān)系。紅花中很多糖普類化合物都是由酚羥基和葡萄糖縮合而成。例如6羥基山萘酚30葡萄糖苷，6羥基山萘酚7O葡萄糖苷，新紅花苷，槲皮苷等[14]。糖苷鍵上的葡萄糖被糖苷水解酶水解之后生成的苷元相比未水解的苷元吸收效果更好，同時提高了生物利用率，紅花中的有效成分可更好地發(fā)揮藥理作用。

前期準(zhǔn)備工作將C213和紅花共發(fā)酵物質(zhì)的成分采用HPLC做了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅花中消失了一個保留時間為7624分的吸收峰，新出現(xiàn)了2個保留時間1245分的吸收峰。發(fā)酵后血栓能力的提高可能對其造成了影響，最根本的是與C213的發(fā)酵炮制有關(guān)系[15]。深入研究需采用磁共振成像等先進設(shè)備。

微生物的分解轉(zhuǎn)化能力極強，能夠產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，利用微生物發(fā)酵技術(shù)來炮制中藥，微生物技術(shù)改變藥物理性比物理化學(xué)炮制手段提高藥性更強，而且還可以降低藥物的不良反應(yīng)，擴大了適應(yīng)證[16]。但微生物技術(shù)在藥物炮制中的潛能并沒有徹底發(fā)揮出來，所以說深入研究微生物在中藥炮制中的物質(zhì)基礎(chǔ)對中藥現(xiàn)代化和新的活性產(chǎn)物有著非常重要的意義。

微生物發(fā)酵就是利用微生物代謝過程來產(chǎn)生酶，產(chǎn)生的酶能夠催化底物，目前的微生物整體細胞能夠為反應(yīng)催化劑的生物催化技術(shù)和生物轉(zhuǎn)化提供較好的基礎(chǔ)，其專一性強，條件簡單，是生物轉(zhuǎn)化技術(shù)中發(fā)展最為迅猛的分支之一，尤其是提取分離技術(shù)的改進，分離技術(shù)的改進使微生物發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用不在局限于小分子的轉(zhuǎn)化和藥物釀造，而是廣泛用于天然化合物的生物合成、生物催化物的合成、光學(xué)活性化合物的拆分、新藥物的開發(fā)、藥物前體化合物的轉(zhuǎn)化等各種領(lǐng)域[17]。到目前為止，微生物技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于50多種反應(yīng)，其中有水解、酯化、水合、?；⒚撍?、氨化、芳構(gòu)化、異構(gòu)化等有機化學(xué)反應(yīng)，還有羥基化、脫氫、氫化、環(huán)氧化等各類氧化還原反應(yīng)以及各類重要藥物的合成轉(zhuǎn)化領(lǐng)域[18]。

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（2017-08-09收稿責(zé)任編輯：王明）