應激耐受多系分化細胞的研究進展

張坤 李芳 延冰 肖東杰 汪運山 劉華

【摘要】應激耐受多系分化（Muse）細胞是一種具有自我更新和多向分化潛能、可向3個胚層分化的細胞，并且具有非致瘤性和低端粒酶活性，其在維持人體內穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著重要作用。該文就Muse細胞的分離培養(yǎng)、生物學特性等研究進展作一介紹。

【關鍵詞】應激耐受多系分化細胞；生物學特性；臨床前研究；干細胞

Research progress on multilineagedifferentiating stress enduring cellsZhang Kun， Li Fang， Yan Bing， Xiao Dongjie， Wang Yunshan， Liu HuaLaboratory of Cell Therapy and Translational Medicine， Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University， Shandong Research Center of Transplantation and Tissue， Jinan 250013， China

Corresponding author， Liu Hua， Email：liuhuagreen@126com

【Abstract】Multilineagedifferentiating stress enduring （Muse）cells possess selfrenewal and multiple differentiation potential Muse cells are able to differentiate into all three germ layers， and exhibit nontumorigenicity and low telomerase activity Muse cells play a significant role in maintaining homeostasis This review summarizes the research progress on the isolation， culture and biological characteristics of Muse cells

【Key words】Multilineagedifferentiating stress enduring cell； Biological characteristics；

Preclinical research； Stem cell

應激耐受多系分化（Muse）細胞是從骨髓間充質細胞和皮膚纖維母細胞中分離出的一種新型的多能干細胞[1]。Muse細胞被認為是人體內唯一的多能干細胞，能夠維持人體的穩(wěn)態(tài)。Muse細胞具備與胚胎干細胞及誘導性多能干細胞相似的生物學特性，能夠多向分化為3個胚層，并具有自我更新能力，同時Muse細胞又具有自身的特性——低端粒酶活性和非致瘤性[2]。Muse細胞的特性使其在組織的再生與修復方面有著巨大的應用潛能。筆者通過以下幾點進行概述。

一、Muse細胞的分離培養(yǎng)及表面標志

一般情況下，組織干細胞僅存在于干細胞所屬的組織中，例如，神經干細胞僅存在大腦中，造血干細胞在骨髓中。但Muse細胞是一類獨特的干細胞，其分布在整個人體而非局限于某個特定的器官或組織中。Muse細胞能直接從骨髓、脂肪、真皮及結締組織中分離，也能夠從培養(yǎng)的成纖維細胞及間充質干細胞中獲得[1，34]。Muse細胞最初被認為是壓力耐受細胞，將間充質或成纖維細胞在胰酶或無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后發(fā)現(xiàn)大部分細胞死亡，而剩余的存活細胞中Muse細胞的比例很高[4]。目前Muse細胞的分離培養(yǎng)尚無統(tǒng)一的方法，一般采用最開始的胰蛋白酶長時間消化法進行分離培養(yǎng)，也可用磁珠分離或流式分選得到。

因在組織中比例較少，組織來源的Muse細胞并不是臨床應用的最好來源，成纖維細胞和間充質細胞中Muse細胞比例相對較多。例如骨髓組織中，CD105/SSEA3雙陽的Muse細胞的比例為003%，而成纖維細胞和骨髓間充質細胞中Muse細胞的比例為1%～6%[1]。所以就臨床應用而言，從培養(yǎng)的成纖維細胞或間充質細胞中分離得到Muse細胞更具前景。

Muse細胞表達間充質干細胞的表面標志CD105以及胚胎干細胞的表面標志[特異性胚胎抗原3（SSEA3）]。Muse細胞在普通培養(yǎng)板中呈成纖維細胞樣形態(tài)，單個Muse細胞懸浮培養(yǎng)后，能形成和胚胎干細胞的擬胚體類似的細胞團，并表達多能干細胞相關標志物，如Oct3/4、Sox2、Nanog和堿性磷酸酶等，但不表達其他干細胞的標志物，如造血干細胞（CD34）、皮膚前體細胞（Snail）、神經前體細胞（CD271）、血管周細胞（CD146）和內皮前體細胞（CD31）等[5]。

二、Muse細胞的胚層分化及自我更新能力

Muse細胞是多能干細胞，能自發(fā)分化為3個胚層的細胞，也可以在細胞因子的誘導下分化成為3個胚層的細胞[6]。 Muse細胞自發(fā)分化的效率并不高，但在特定的誘導條件下其分化效率可增高，Wakao等（2011年）的一項研究顯示，在肝細胞、神經細胞特定培養(yǎng)條件下，Muse細胞能夠有效分化。并不需要轉導外源性的基因。盡管Muse細胞具有多能性，但其在自發(fā)分化時更趨向于分化為中胚層細胞[1]。2013年Yang等將單個Muse細胞懸浮培養(yǎng)的細胞集落轉移到明膠中培養(yǎng)擴增，可見3個胚層的表面標志物均有表達。細胞重新進行黏附培養(yǎng)時可見新的細胞集落生成。重復3次后對細胞集落進行分析依然可見3個胚層的表面標志物，證明Muse細胞能夠自我更新并保持分化為3個胚層的能力。

三、Muse細胞的非致瘤性和低端粒酶活性

Muse細胞與胚胎干細胞及誘導性多能干細胞相似，均表達Nanog、Oct3/4和Sox2等多能基因。不同的是，Muse細胞端粒末端轉移酶活性較低，在體內不會形成腫瘤[7]。將胚胎干細胞和誘導性多能干細胞接種到免疫缺陷小鼠中，8～12 周后可形成畸胎瘤，然而將Muse 細胞移植至免疫缺陷小鼠體內，6個月后卻無形成畸胎瘤[1]。研究證明Muse 細胞具有較低水平的端粒酶活性，與胚胎干細胞及誘導性多能干細胞的基因表達相比，Muse 細胞的基因表達與細胞周期性進展有關，其端粒酶活性和基因表達水平與體細胞水平相當[8]。2011年Wakao等發(fā)現(xiàn)，與胚胎干細胞及誘導性多能干細胞相比，Muse 細胞表達的“Yamanaka因子”低105倍，“Yamanaka因子”已被證明賦予細胞多能性和致瘤性，這或許可以解釋 Muse 細胞如何保持其多能性，而不會形成畸胎瘤。

四、Muse細胞和非Muse細胞的不同角色

Muse細胞和非Muse細胞之間存在明顯的差異。首先，非Muse細胞不能在懸浮條件下形成Muse細胞樣的細胞簇[1]。非Muse細胞貼壁培養(yǎng)才能存活。其次，Muse細胞表達多能性基因，而非Muse 細胞并不表達，因此，非Muse細胞不具有多能性，不能分化為神經細胞（外胚層）、肝細胞（內胚層）甚至是同為中胚層的骨骼肌細胞等[9]。研究證明，人類成纖維細胞來源的Muse細胞能夠跨過中胚層和外胚層的界限，分化為有功能的黑色素細胞。而非Muse細胞不能分化為有功能的黑色素細胞。證明Muse細胞在多能性方面顯著高于非Muse細胞[10]。研究顯示將皮膚成纖維細胞分為Muse細胞及非Muse細胞，非Muse細胞不能像Muse細胞一樣被誘導為誘導性多能干細胞，因此間充質干細胞的多向分化和組織修復作用可能主要通過其中的Muse細胞實現(xiàn)[11]。與 Muse細胞相反，非Muse細胞扮演的角色是復雜而多面的。盡管非Muse細胞無Muse細胞的3個胚層分化能力，但其具有營養(yǎng)、抗炎和免疫抑制作用，可以協(xié)同 Muse細胞發(fā)揮組織修復作用[12]。

五、Muse細胞的組織修復功能

胚胎干細胞及誘導性多能干細胞應用于臨床之前需要滿足以下條件：①必須體外分化為目的細胞；②在移植之前必須將未分化的多能干細胞清除。需滿足上述準備條件是因為胚胎干細胞及誘導性多能干細胞在體內能形成畸胎瘤，高效的分化體系也不能保證分化率達到100%，仍會有少量的未分化細胞存在，仍存在致畸的風險。但對Muse細胞而言則無需上述條件， Muse細胞具有非致瘤性和低端粒酶活性，故其在臨床使用前不需要大規(guī)模的處理程序，使用較方便。同時Muse細胞有能力遷移并整合到受損區(qū)域，然后自發(fā)分化為與組織兼容的靶細胞，因此，Muse細胞能在眾多組織和器官中充當“修復細胞”[13]。例如，將綠色熒光蛋白標記的Muse細胞靜脈注射到皮膚、肌肉和肝組織受損的免疫缺陷小鼠體內，其能在小鼠體內特異性分化，在移植后2～4周內表現(xiàn)為極強大的組織再生能力，形成真皮、腓腸肌肌肉和肝臟組織[1，1415]。研究顯示，將Muse細胞分化的黑色素細胞移植到小鼠受損皮膚內，黑色素細胞色素化，檢測到人黑色素細胞標志物陽性，這表明Muse細胞可能可作為一種理想的種子細胞而用于自體移植治療色素障礙性疾病，如白癜風等[10，16]。最近的研究顯示Muse細胞可被誘導為角質形成細胞、成纖維細胞及黑色素細胞，并且Muse細胞來源的細胞可以分化為完整的皮膚組織，Muse細胞在皮膚再生方面有著廣闊的應用前景[17]。有研究表明在急性心肌梗死患者中，急性期Muse細胞數(shù)量增加較多的患者相較Muse細胞數(shù)量增加較少的患者，其慢性期左心室功能的改善更明顯[18]。攜帶有自殺基因的Muse細胞在治療惡性膠質瘤中也表現(xiàn)出較強的安全性及遷移殺傷作用，表明Muse細胞在異基因細胞藥物治療方面也有應用潛力[19]。同時Muse細胞能夠歸巢于受損的腎小球，并在系統(tǒng)給藥后自發(fā)分化成腎小球細胞[20]。在卒中和腦出血模型中Muse細胞能與宿主腦微環(huán)境整合后高比例分化為神經元細胞，并能重構神經元回路以減輕神經受損癥狀[2122]。在免疫調節(jié)方面Muse細胞具有抗炎活性，能減少促炎性細胞因子如IFNγ和TNFα的分泌，Muse細胞可以潛在用作免疫調節(jié)劑來治療免疫相關疾病[23]。

六、結語

自干細胞被發(fā)現(xiàn)以來，其多向分化潛能被學者們期待能用來治療各種疾病[24]。因倫理和致瘤性問題，胚胎干細胞及誘導性多能干細胞的臨床應用受到限制。間充質干細胞雖然無致瘤的相關報道，但其在組織再生與功能修復方面仍存在很大爭議。Muse細胞能從皮膚、脂肪、骨髓中獲得，也可從間充質干細胞中分離得到，有不斷自我更新的能力、低端粒酶活性和非致瘤性，而且其在體內能整合到損傷部位，具有較強的組織修復能力。Muse細胞在維持人體內在穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著重要作用，下一步的研究重點在于明確Muse細胞維持人體內在穩(wěn)態(tài)過程的機制。

總之，Muse細胞來源廣泛、取材方便、在不同的理化環(huán)境和細胞因子的誘導下具有多向分化潛能，是組織工程、細胞移植及基因治療領域的理想靶細胞，為臨床上多種疾病的治療提供了廣闊的前景。

參考文獻

[1]Kuroda Y， Kitada M， Wakao S， Nishikawa K， Tanimura Y， Makinoshima H， Goda M， Akashi H， Inutsuka A， Niwa A， Shigemoto T， Nabeshima Y， Nakahata T， Nabeshima Y， Fujiyoshi Y， Dezawa M Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations Proc Natl Acad Sci U S A， 2010， 107（19）： 86398643

[2]Fisch SC， Gimeno ML， Phan JD， Simerman AA， Dumesic DA， Perone MJ， Chazenbalk GD Pluripotent nontumorigenic multilineage differentiating stress enduring cells （Muse cells）： a sevenyear retrospective Stem Cell Res Ther， 2017， 8（1）：227

[3]Liu Q， Zhang RZ， Li D， Cheng S， Yang YH， Tian T， Pan XR Muse cells， a new type of pluripotent stem cell derived from human fibroblasts Cell Reprogram， 2016， 18（2）：6777

[4]Wakao S， Akashi H， Kushida Y， Dezawa M Muse cells， newly found nontumorigenic pluripotent stem cells， reside in human mesenchymal tissues Pathol Int， 2014， 64（1）：19

[5]Tsuchiyama K， Wakao S， Kuroda Y， Ogura F， Nojima M， Sawaya N， Yamasaki K， Aiba S， Dezawa MFunctional melanocytes are readily reprogrammable from multilineagedifferentiating stressenduring （muse） cells， distinct stem cells in human fibroblasts J Invest Dermatol， 2013， 133（10）：24252435

[6]Kuroda Y， Dezawa M Mesenchymal stem cells and their subpopulation， pluripotent muse cells， in basic research and regenerative medicine Anat Rec （Hoboken）， 2014， 297（1）：98110

[7]Ogura F， Wakao S， Kuroda Y， Tsuchiyama K， Bagheri M， Heneidi S， Chazenbalk G， Aiba S， Dezawa M Human adipose tissue possesses a unique population of pluripotent stem cells with nontumorigenic and low telomerase activities： potential implications in regenerative medicine Stem Cells Dev， 2014， 23（7）：717728

[8]Simerman AA， Perone MJ， Gimeno ML， Dumesic DA， Chazenbalk GD A mystery unraveled： nontumorigenic pluripotent stem cells in human adult tissues Expert Opin Biol Ther， 2014， 14（7）：917929

[9]Kuroda Y， Wakao S， Kitada M， Murakami T， Nojima M， Dezawa MIsolation， culture and evaluation of multilineagedifferentiating stressenduring （Muse） cells Nat Protoc， 2013， 8（7）：13911415

[10]Yamauchi T， Yamasaki K， Tsuchiyama K， Koike S， Aiba S The potential of muse cells for regenerative medicine of skin： procedures to reconstitute skin with muse cellderived keratinocytes， fibroblasts， and melanocytes J Invest Dermatol， 2017， 137（12）：26392642

[11]Wakao S， Kitada M， Dezawa M The elite and stochastic model for iPS cell generation： multilineagedifferentiating stress enduring （Muse） cells are readily reprogrammable into iPS cells Cytometry A， 2013， 83（1）：1826

[12]Heneidi S， Simerman AA， Keller E， Singh P， Li X， Dumesic DA， Chazenbalk G Awakened by cellular stress： isolation and characterization of a novel population of pluripotent stem cells derived from human adipose tissue PLoS One， 2013， 8（6）： e64752

[13]Simerman AA， Phan JD， Dumesic DA， Chazenbalk GD Muse cells： nontumorigenic pluripotent stem cells present in adult tissuesa paradigm shift in tissue regeneration and evolution Stem Cells Int， 2016， 2016：1463258

[14]Iseki M， Kushida Y， Wakao S， Akimoto T， Mizuma M， Motoi F， Asada R， Shimizu S， Unno M， Chazenbalk G， Dezawa M Muse cells， nontumorigenic pluripotentlike stem cells， have liver regeneration capacity through specific homing and cell replacement in a mouse model of liver fibrosis Cell Transplant， 2017， 26（5）：821840

[15]Katagiri H， Kushida Y， Nojima M， Kuroda Y， Wakao S， Ishida K， Endo F， Kume K， Takahara T， Nitta H， Tsuda H， Dezawa M， Nishizuka SS A distinct subpopulation of bone marrow mesenchymal stem cells， muse cells， directly commit to the replacement of liver components Am J Transplant， 2016， 16（2）：468483

[16]Yamauchi T， Yamasaki K， Tsuchiyama K， Koike S， Aiba SA quantitative analysis of multilineagedifferentiating stressenduring （Muse） cells in human adipose tissue and efficacy of melanocytes induction J Dermatol Sci， 2017， 86（3）：198205

[17]Hu MS， Longaker MT A Muse for skin regeneration J Invest Dermatol， 2017， 137（12）：24712472

[18]Tanaka T， Nishigaki K， Minatoguchi S， Nawa T， Yamada Y， Kanamori H， Mikami A， Ushikoshi H， Kawasaki M， Dezawa M， Minatoguchi S Mobilized muse cells after acute myocardial infarction predict cardiac function and remodeling in the chronic phase Circ J， 2017， 82（2）：561571

[19]Yamasaki T， Wakao S， Kawaji H， Koizumi S， Sameshima T， Dezawa M， Namba H Genetically engineered multilineagedifferentiating stressenduring cells as cellular vehicles against malignant gliomas Mol Ther Oncolytics， 2017， 6：4556

[20]Uchida N， Kushida Y， Kitada M， Wakao S， Kumagai N， Kuroda Y， Kondo Y， Hirohara Y， Kure S， Chazenbalk G， Dezawa M Beneficial effects of systemically administered human muse cells in adriamycin nephropathy J Am Soc Nephrol， 2017， 28（10）：29462960

[21]Uchida H， Niizuma K， Kushida Y， Wakao S， Tominaga T， Borlongan CV， Dezawa MHuman Muse cells reconstruct neuronal circuitry in subacute lacunar stroke model Stroke， 2017， 48（2）：428435

[22]Shimamura N， Kakuta K， Wang L， Naraoka M， Uchida H， Wakao S， Dezawa M， Ohkuma HNeuroregeneration therapy using human Muse cells is highly effective in a mouse intracerebral hemorrhage model Exp Brain Res， 2017， 235（2）：565572

[23]Gimeno ML， Fuertes F， Barcala Tabarrozzi AE， Attorressi AI， Cucchiani R， Corrales L， Oliveira TC， Sogayar MC， Labriola L， Dewey RA， Perone MJ Pluripotent nontumorigenic adipose tissuederived muse cells have immunomodulatory capacity mediated by transforming growth factorβ1 Stem Cells Transl Med， 2017， 6（1）：161173

[24]蔡亮鳴，王昭妮， 陳壯桂間充質干細胞對重癥支氣管哮喘治療作用的研究進展 新醫(yī)學， 2017，48（5）：285292

（收稿日期：20180120）

（本文編輯：洪悅民）